Jméno: Datum: Téma 02: Životaschopnost (vitalita) pylu a metody její detekce Životaschopnost pylu je jedním z hlavních faktorů, které rozhodují o úspěšnosti oplození. Byla popsána řada metod, které testují životaschopnost pylu přímo = klíčení pylu in vitro na umělých médiích nebo nepřímo = barvením pylových zrn. Důležitými faktory klíčivosti pylu je kromě složení média teplota, pH, relativní vlhkost vzduchu, zralost pylu i hustota suspenze. Materiál: květy tradeskancie (Tradescantia pallia (Rose) D.R.Hunt, syn. Setcreasea purpurea Rose), streptokarus, brambořík, kopřivěnka, ibišek suchý pyl dýně (Cucurbita pepo L.), lilie (Lilium hybr.), borovice (Pinus sylvestris L.), apod. médium pro klíčení pylových zrn (Brewbaker et Kwack 1964): 100 ml 10% sacharosa 10 g H[3]BO[3] 10 mg Ca(NO[3])[2] . 4 H[2]O 30 mg MgSO[4] . 7 H[2]O 20 mg KNO[3] 10 mg Úprava médií: kromě 10% sacharózy, vytvoříme variantu bez sacharózy, s 10% sacharózou bez kys. Borité a jednu variantu v destilované vodě. médium pro klíčení pylových zrn (Boavida et McCormick 2007): 100 ml 10% sacharosa 10 g H[3]BO[3] 10 mg (1,6 mM) CaCl[2].2H[2]O 73,5 mg (5 mM) MgSO[4].7H[2]O 24,6 mg (1 mM) KCl 37,2 mg (5 mM) 1.5% low-melting agarose 1,5 g pH 7,5 Alexandrova barvící směs pro diferenciální barvení pylu (Alexander 1969) 95% ethanol 10 ml malachitová zeleň 10 mg (1 ml 1% roztoku v 95% ethanolu)‏ destilovaná voda 50 ml glycerol 25 ml fenol 5 g chloralhydrát 5 g kyselý fuchsin 50 mg (5 ml 1% vodného roztoku)‏ oranž G 5 mg (0,5 ml 1% vodného roztoku)‏ ledová kys. octová 1 - 4 ml A. Diferenciální barvení pylu Postup I.: 1. Na podložní sklo nakápneme několik kapek Alexanderovy barvící směsi. 2. Do kapky barviva naprášíme pylová zrna a přikryjeme krycím sklem. 3. Po několika minutách vyhodnotíme zbarvení pylových zrn. Poznámka 1 : Vzhledem k tomu, že chloralhydrát a fenol jsou na seznamu nebezpečných chemických látek a vyžadují speciální bezpečnostní zacházení i likvidaci odpadu, testovali Peterson et. al. (2010) použití barvící směsi s vynecháním těchto látek a zjistili, že výsledky jsou víceméně srovnatelné s původní metodou Alexandera (Alexander 1969). Ke zlepšení penetrace barviva autoři navrhují použití Carnoyovy fixáže a zahřátí preparátu při barvení. Upravená barvící směs bez toxických látek (Peterson et al. 2010) 95% ethanol 10 ml malachitová zeleň 1 ml 1% roztoku v 95% ethanolu‏ destilovaná voda 50 ml glycerol 25 ml kyselý fuchsin 5 ml 1% vodného roztoku)‏ oranž G 0,5 ml 1% vodného roztoku ledová kys. octová 4 ml + destilovaná voda 4,5 ml = celkový objem směsi 100 ml Postup II.: (Peterson et al. 2010): 1. Fixace poupat nebo izolovaných prašníků v Carnoyově fixační směsi alespoň 2 hod. Ve fixáži je možno skladovat materiál až 12 měsíců. 2. Umístění prašníku na podložní sklo a odsátí fixáže. 3. Přidání 2 – 4 kapek barvící směsi. 4. Zahřátí skla protažením nad plamenem kahanu téměř k varu – zlepšuje se penetrace barviva dovnitř pylových zrn. 5. Přikrytí krycím sklem a jeho jemné přitlačení zajistí srovnání pylových zrn do jedné roviny. Výsledek: Dobře vyvinutá pylová zrna jsou zbarvena červeně, abortovaná pylová zrna jsou zelená. Hodnocení: Zjistíme poměr vyvinutých a abortovaných pylových zrn. Poznámka 2: Histologické barvení pylových zrn může vitalitu pylu nadhodnocovat, přesnější bývají histochemické metody detekující aktivitu proteinů, např. hydrolytických enzymů (pro esterázy je substrátem fluorescein diacetát , FDA) nebo oxidačně-redukčních enzymů (pro dehydrogenázy je substrátem trifenyltetrazolium chlorid, TTC, který váže vodík uvolněný dehydrogenázami za tvorby červeného reakčního produktu formazanu). B. Testování klíčivosti pylu in vitro I. Postup: 1. Na podložní sklo naneseme kapku média (Brewbaker and Kwack 1964), do které naprášíme testovaná pylová zrna. 2. Inkubaci provádíme ve vlhké komůrce metodou stojící nebo visící kapky. 3. Po 30 min. intervalech kontrolujeme četnost klíčících pylových zrn a délku pylových láček. Hodnocení: Vyhodnotíme rychlost klíčení pylu v různých médiích a četnost klíčících pylových zrn u předložených vzorků. V závěru slovně okomentujte získané výsledky. II. Postup: 1. Vytvořit rámeček pomocí PAP pera. 2. Rozehřáté inkubační médim s agarosou nebo agarem (Boavida et McCormick 2007) napipetovat na podložní sklo, na jedno sklo mělo by stačit 500 – 750 ml. 3. Nechat zatuhnout médium v polštářek. 4. Naprášit pyl na povrch média (nebo vytřepat pyl z otevřených květů do media bez agarosy v 1 ml mikrozkumavce, po krátké jemné centrifugaci nebo sedimentaci, odpipetování pylového peletu a přenesení na polštářek - "výsev" pylu je tak mnohem rovnoměrnější a celková klíčivost se více blíží skutečnosti - při nepravidelném chomáčovitém výsevu více klíčí zrna ve skupinách než samostatně). 5. Vložení skla do vlhké komůrky (uzavíratelná plastová nebo skleněná krabička vypodložená mokrým filtračním papírem) na špejle, aby voda nevzlínala na polštářek. 6. Inkubace v termostatu na 25°, kultivace ve tmě, ON. Literatura: Alexander M. P. (1969): Differential staining of aborted and nonaborted pollen. - Stain Technol., 44: 117-22. Brewbaker J. L. and Kwack B. H. (1964): The Calcium Ion and Substances Influencing Pollen Growth. In: "Pollen Physiology and Fertilization", Linskens, H. F. (Ed.). North Holland, Amsterdam, pp. 143–151. Boavida, L.C. and McCormick, S. (2007): Temperature as a determinant factor for increased and reproducible in vitro pollen germination in Arabidopsis thaliana. - Plant J. 52: 570-582. Peterson R., Slovin J.P., Chen Ch. (2010): A simplified method for differential staining of aborted and non-aborted pollen grains. - International J. Plant Biol. 2010; 1:e13 doi:10.4081/pb.2010.e13 Williams J. H. (2012): The evolution of pollen germination timing in flowering plants: Austrobaileya scandens (Austrobaileyaceae). - AoB PLANTS 2012: pls010; doi:10.1093/aobpla/pls010, available online at www.aobplants.oxfordjournals.org