Obrázek 1. Schéma experimentu.

Grafický postup experimentu. (1) 18-ti hodinová kultura kmene S. aureus citlivá k streptomycinu, (2) příprava husté bakteriální suspenze, stanovení titru buněk v 1 ml směsi (CFU/ml) na plotnách s MPA, (3) výsev bakteriální suspenze na gradientní plotny s obsahem streptomycinu o různých koncentracích.

Obrázek 2. Gradientní plotna.

Nárůst kultury bakteriálního kmene na gradientní plotně s přídavkem streptomycinu.

Postup:

A. Izolace spontánních mutant

1. den

1. Z 18-ti hodinové bakteriální kultury kultivované na MPA odebrat 5 kliček a resuspendovat ve 3 ml MPB.
2. Z připravené suspenze stanovit titr buněk (CFU/ml) rozsevem 100 µl z ředění 10^-6, 10^-7, 10^-8, od jednoho ředění provést výsev na 3 misky s MPA. Kultivace při 37°C/20 hod.
   
3.  Připravit gradientní plotny se streptomycinem o výsledných koncentracích: 10, 50, 100 a 500 µg/ml. Zásobní roztok streptomycinu přidat do rozvařené MPA půdy, předem vytemperované na max. 55°C.
   
4. Provést rozsevy bakteriální suspense po 100 µl na gradientní plotny, 3 plotny od příslušné koncentrace (Obr. 1). 
5. Kultivovat při 37°C/48 hod.

Obrázek 3. Izolace rezistentních mutant.

Ověření necitlivosti mutant k antibiotiku

2. – 3. den

1. Vyhodnocení nárůstu kultury na gradientních plotnách s antibiotikem.  Jednotlivé kolonie za linií kompaktního nárůstu lze považovat za mutované bakterie (Obr. 2.). Spočítat všechny domnělé mutanty.

   

   Obrázek 4. Výsledek fluktuačního testu.

   Nárůst mutant S. aureus na MPA s antibiotikem
2. Přečárkovat vybrané mutanty sterilním párátkem na MPA se streptomycinem o koncentracích 5, 10, 50, 100 a 500 µg/ml (Obr. 3). 
3. Kultivovat při 37°C/20 hod.
   
4. Hodnotit izolované mutanty testovaného kmene S. aureus (Obr. 4).

B. výpočet frekvence spontánních mutací.

Stanovit počet získaných mutant a určit frekvenci mutací k jednotlivým koncentracím streptomycinu. Výpočet mutačního indexu (F):

F =

Mu – počet získaných mutant v 1 ml původní suspenze

N – počet buněk v 1 ml původní suspenze

C. Stanovení citlivosti kmenů ke streptomycinu

1. den

1. Stanovit citlivost kmenů k streptomycinu. Z připravené suspense testovaného kmene odebrat 100 µl a vyset přes 0,7%  MPA vytemperovaný na 45°C na plotnu s 2% MPA. Po utuhnutí vykápnout antibiotikum (10, 50, 100 a 500 µg/ml) na povrch agarové plotny a po vsáknutí kultivovat při 37°C/20 hod. Jako kontrolu použít kmen S. aureus rezistentní ke streptomycinu.

2. den

1.  Vyhodnotit test ověření citlivosti testovaného kmene k antibiotiku.