Bi7311: Praktikum z molekulární biologie prokaryot

Pulzní gelová elektroforéza (PFGE)

Pulzní gelová elektroforéza (PFGE) je elektroforetická metoda umožňující na rozdíl od klasické elektroforézy efektivní dělení molekul DNA větších než 15 kb (až do velikosti několika Mb).

Při pulzní elektroforéze se periodicky mění orientace elektrického pole (Obr. 15). Molekuly DNA v agaróze se relaxují při odstranění jednoho pole a zaujímají určitou konformaci při působení nového pole. Tento proces reorientace je závislý na velikosti molekul.

Obrázek 15. Pulzní gelová elektroforéza.
Elektrické pole se periodicky mění ve třech směrech (a) směrem od středu gelu, (b, c) v úhlu 60° po obou stranách gelu.

Při přípravě vzorků větších než 500 kb je nutné molekuly DNA chránit před mechanickým poškozením (působení střižných sil) a před nukleolytickou degradací během izolace. Proto se používá speciální metoda izolace, při které jsou buňky nejprve fixovány v nízkotající agaróze a teprve potom je prováděna lyze a purifikace DNA (Obr 16).

Obrázek 16. Obecné schéma přípravy vzorků pro PFGE.

Základní pojmy:


Pulzní pole (pulsed field): Elektroforetický proces, který používá více než jedno elektrické pole, a ve kterém se elektrická pole střídavě aktivují.

Pulzní interval (switch interval, switch time, pulse time): Čas, po který je každé ze střídajících se elektrických polí aktivováno.

Reorientační úhel (reorientation angle): Úhel mezi dvěma střídajícimi se elektrickými poli, tj. úhel mezi různými směry, ve kterých molekuly DNA putují.

Homogenní pole (homogeneous field): Elektrické pole, které má uniformní potenciálové rozdíly po celém poli.


Úloha: Izolace bakteriální DNA pro pulzní gelovou elektroforézu a provedení pulzní gelové elektroforézy
Přejít

Předchozí
Následující