Plazmidy jsou autonomní kovalentně uzavřené kružnicové replikony tvořené dsDNA, které se stabilně dědí v extrachromozomálním stavu a jsou pro buňku, na rozdíl od chromozomální DNA, postradatelné. Nesou geny, které nejčastěji kódují rezistenci k antibiotikům. Počet kopií v buňce je nepřímo úměrný velikosti plazmidu. K přípravě vektorů jsou používány plazmidové DNA o nižší molekulové hmotnosti, neboť poskytují více kopií a snadnější manipulaci. V současnosti jsou plazmidové vektory využívány ke klonování v E. coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida aj.

Pro izolaci plazmidové DNA z buněk se používá řada různých metod. Všechny musí obsahovat čtyři základní kroky:

1. Růst bakteriální kultury. Plazmidy se nejčastěji izolují z bakteriální kultury (rostoucí v médiu obsahující příslušné antibiotikum), která byla inokulována jednou kolonií odpíchnutou z agarové plotny. Většina plazmidových vektorů používaných v současné době (např. pUC řada) se replikuje jako vícekopiové vektory a je u nich možné dosáhnout vysokého výtěžku při izolaci z kultury, která rostla ve standardním LB médiu do logaritmické fáze růstu. Avšak vektory dřívější generace (např. pBR322), které se nereplikují tak snadno, vyžadují selektivní amplifikaci několikahodinovou inkubací částečně rostoucí kultury v médiu s chloramfenikolem, který inhibuje syntézu proteinů a tak zabraňuje replikaci bakteriálního chromozómu, avšak replikace relaxovaných plazmidů pokračuje a počet jejich kopií se zvyšuje.
2. Izolace bakterií a jejich lyze. Bakterie jsou získány centrifugací a lyzovány jednou z mnoha metod zahrnujících působení detergentů, organických rozpouštědel, alkalického pH nebo tepla. Volba jedné z těchto metod závisí na velikosti plazmidu, bakteriálním kmeni a metodě, která bude následně použita pro purifikaci plazmidové DNA. Velké plazmidy (> 15 kb), které jsou citlivé na poškození, by měly být izolovány metodou minimalizující působení fyzikálních sil (lyze dodecylsulfátem sodným). Pro malé plazmidy je možné použít více metod.
   
3. Oddělení plazmidové DNA od ostatních vysoko a nízkomolekulárních komponent. Po přidání EDTA a v některých případech lyzačních enzymů jsou buňky vystaveny působení detergentu a lyzovány varem nebo alkalicky. To způsobí denaturaci chromozomální DNA, která je obvykle již ve formě lineárních fragmentů a během renaturace se spojí se zbytky lyzovaných buněk a rychle klesá při centrifugaci na dno zkumavky. Naproti tomu vlákna plazmidové DNA, tvořená kovalentně uzavřenými molekulami se při denaturaci nerozcházejí, protože jsou v důsledku nadšrubovicové struktury vzájemně propletená a mohou na rozdíl od lineárních fragmentů rychle renaturovat. Lyze varem není doporučována při izolaci z kmenů produkujících endonukleázu A. Endonukleáza A není varem kompletně inaktivována a plazmidová DNA může být degradována během následných inkubací za přítomnosti Mg2+. Tomuto problému lze předejít zařazením extrakce s fenol-chloroformem.
4. Purifikace plazmidové DNA a stanovení koncentrace a čistoty. Proteiny odstraňujeme extrakcí směsí fenol-chloroform. Precipitaci DNA provádíme 96 % ethanolem po přidání jednomocných iontů. Odstranění RNA provádíme působením pankreatickou RNázou. Vysoce čisté kovalentně uzavřené kružnicové DNA je možné získat po centrifugaci v gradientu CsCl-ethidium bromid. Z dalčích metod je možné použít pro purifikaci plazmidové DNA precipitaci polyetylén glykolem, chromatografii a komerční metody využívající adsorpci na silikagelovou kolonku.