Obrázek 7. Bakteriofág phiJB.

Snímek z transmisního elektronového mikroskopu (TEM).

Obrázek 8. Přenos plazmidů pT181, pHOUMR-like do recipientního kmene RN4220 transdukcí.

Po indukci bakteriofága z donorového kmene Jevons B dochází k uvolnění fágového potomstva. Transdukující lyzát je pomnožen na recipientním kmeni RN4220 a pomocí vhodných selekčních médií jsou selektovány buňky obsahující plazmidy s geny rezistence (transduktanty).

V úloze se pracuje s bakteriofágem фJB, který byl indukován UV zářením z donorového kmene S. aureus Jevons B. Tento donorový kmen obsahuje dva plazmidy (pT181, pHOUMR-like). Plazmid pT181 kóduje gen pro rezistenci k tetracyklinu, plazmid pHOUMR-like gen pro rezistenci k β-laktamovým antibiotikům a ke kadmiu. Úkolem bude připravit kmen RN4220 obsahující plazmid pT181 a dále kmen RN4220 s plazmidem pHOUMR-like (Obr. 8).

Postup:

Úloha zahrnuje několik dílčích kroků:

1. transdukce plazmidů.
2. stanovení titru recipientního kmene (CFU/ml) a titru fágového lyzátu (PFU/ml).
3. výpočet frekvence transdukce.
4. ověření přenosu plazmidových genů rezistence (tetK a blaZ) pomocí PCR
5. ověření úspěšnosti transdukce pomocí pulzní gelové elektroforézy (PFGE).

A. Transdukce plazmidů.

1. Zaočkovat recipientní kmen (20 µl zamražené kultury do 20 ml MPB) a inkubace 37 °C / 18 hod.
2. Přidat roztok CaCl₂ (zás. roztok 20 mM) ke kultuře recipientního kmene do výsledné koncentrace 2 mM.
3. Smíchat 1 ml kultury recipienta s 1 ml transdukujícího fágového lyzátu tak, že hodnota multiplicity infekce (poměr počtu fágových částic k počtu buněk) bude max. 1.
4. Inkubovat transdukční směs při 37 °C / 25 min. za stálého třepání.
5. Přidat roztok citrátu sodného (zás. roztok 0,1 M) k transdukční směsi do výsledné koncentrace 15 mM, centrifugovat 3000 rpm / 10 min. / 4–8 °C a resuspendovat pelet v roztoku 17 mM citrátu sodného (objem pro resuspendaci závisí na počtu misek, na které se bude transdukční směs vysévat a na množství směsi vyseté na jednu misku (ideálně 100–300 µl).
6. Vyset transdukční směs na misky s MPA obohaceným o citrát sodný (20 mM) a tetracyklin (5 µg/ml) nebo kadmium (2,5.10^-4M).
7. Inkubovat selekční misky s transdukční směsí při 37 °C / 24–48 hod.

B. Stanovení titru recipientního kmene (CFU/ml) a titru fágového lyzátu (PFU/ml).

Stanovení titru bakterií nebo fágových částic vychází z ověřeného předpokladu, že z 1 životaschopné buňky/fágové částice vyrůstá 1 kolonie/1 plaka. Bakteriální kulturu nebo fágový lyzát je třeba ředit, aby se kolonie/plaky po nárůstu nepřekrývali a šlo je spočítat. Titry se provádí na 3 miskách od každého ředění, aby se odhalila případná chyba v provedení, výsledné počty se zprůměrují. Výsledek se uvádí v CFU/ml (colony forming units) pro bakterie a v PFU/ml (plaque forming units) pro fágy.

Postup stanovení titru recipientního kmene (CFU/ml):

1. naředit kulturu 10^-6 až 10^-8dle očekávaného výsledku.
   
   • ředit desítkovou řadou: do 900 μl bujónu 100 μl kultury, promíchat, vyměnit špičku a novou špičkou přenést 100 μl kultury do dalších 900 μl bujónu atd.

   • ředění do plastových mikrozkumavek a plastovými špičkami nebo do sterilních Wassermannových zkumavek a skleněnými pipetami.

2. do zkumavky s 0,7% měkkým masopeptonovým agarem vytemperovaným na 45 °C přidat 100 μl 18-ti hod. bakteriální kultury příslušného ředění (10^-6 až 10^-8) / nebo příslušná ředění bakteriální kultury v objemu 100  μl vyséváme přímo na Petriho misku a rovnoměrně rozetřeme skleněnou hokejkou.
3. od jednoho ředění provést výsev na 3 misky s MPA.
4. kultivovat 18 hod. / 37 °C, misky otočit dnem vzhůru (kondenzující voda).

Postup stanovení titru fágového lyzátu (PFU/ml):

1. naředit fágový lyzát 10^-3 až 10 ^-7 dle očekávaného výsledku.

   • ředit desítkovou řadou: do 900 μl bujónu 100 μl lyzátu, promíchat, vyměnit špičku a novou špičkou přenést 100 μl lyzátu do dalších 900 μl bujónu atd.

   • ředění do plastových mikrozkumavek a plastovými špičkami nebo do sterilních Wassermannových zkumavek a skleněnými pipetami (materiál zvolit na základě doporučení pro daného fága).

2. do zkumavky s 0,7% měkkým masopeptonovým agarem vytemperovaným na 45°C přidat 250 μl 0,02 M CaCl₂, 100 μl 18-ti hod. bakteriální kultury (titrační kmen pro daného fága), 100 μl lyzátu v příslušném ředění (10^-3 až 10 ^-7).
3. od jednoho ředění provést výsev na 3 misky s MPA.
4. kultivovat 18 hod. / 37 °C, misky otočit dnem vzhůru.

C. Výpočet frekvence transdukce.

Zjištění počtu kolonií transduktant na miskách a výpočet frekvence transdukce jako podíl počtu transduktant (CFU/ml – colony-forming units / 1 ml) k počtu fágových částic v transdukujícím lyzátu (PFU/ml – plaque-forming units / 1 ml).

Titry bakteriální kultury a fágového lyzátu počítáme jako průměrné počty kolonií/plak na miskách příslušného ředění. Počty je nutné přepočítan na objem 1ml kultury/lyzátu.

Frekvence transdukce:

A =

Y – teoretický počet transduktant na 1ml transdukční směsi

p – počet virionů (PFU) transdukujícího fága v 1ml transdukční směsi

A - frekvence transdukce  =

D. ověření přenosu plazmidových genů rezistence (tetK a cadD) pomocí PCR.

Úspěšnost transdukce lze v prvním kroku ověřit přítomností genů rezistence v transduktantech pomocí jednoduché PCR. U transduktant selektovaných na plotnách s tetracyklinem zjišťujeme přítomnost genu tetK, u transduktant selektovaných na kadmiu přítomnost genu cadD.

Postup:

Nejprve zjistíme sekvenci obou plazmidů a genů tetK a cadD pomocí databáze NCBI. Zkontrolujeme sekvenci primerů, zda odpovídají sekvencím sledovaných genů.

Reakční směs pro PCR mícháme dle doporučení výrobce (např. FasrStart PCR Master, Roche Diagnostics).

Protokol PCR: