Bi7311: Praktikum z molekulární biologie prokaryot

Úloha: Konjugace kmenů Escherichia coli Hfr a F

Cíl úlohy
Cílem úlohy je stanovit frekvenci konjugace mezi donorovým kmenem E. coli HfrH Reich a E. coli F- 28R801, ověřit vznik transkonjugant. Pozorování změny fenotypových vlastností transkonjugant.
Seznam materiálu

Bakteriální kmeny: Escherichia coli HfrH Reich, Escherichia coli F_ 28R801

Média a materiál:

  • Sterilní laboratorní sklo – Erlenmayerovi baňky 250 ml, 100 ml, 50 ml, 25 ml, petriho misky

Minimální agar: míchá se ze složek A+B+C+D+E (Obr. 10)

Složení jednotlivých komponent minimálního agaru:

  1. vodní agar: 3,96g agaru č. 3 do 180 ml dH2O; autoklávujeme
  2. roztok solí (4x koncentrovaný roztok solí): 20 g NH4Cl; 4g NH4(NO)2;  8g Na2SO4; 12g K2HPO4; KH2PO4; rozpuštěno v 1l dH2O; přidat 1,6 ml z 1M zásobního roztoku MgSO4.7H2O po autoklávování

  3. 2,5 ml 20% glukózy

  4. streptomycin (výsl. konc. 100 g/ml, zás. roztok 100 mg/ml)

  5. thyamin (5 g/ml, zás. roztok 50 mg/ml)

LBA médium: do 1 l dH2O – 10 g Trypton, 5 g Yeast extract, 10 g NaCl, pH 7, autoklávujeme, pro agar přídavek agaru č. 2, na 1 l media 15 g agaru

PNS médium: do 1 l dH2O – 1 g glukózy, 1,5 g Bacto beef extract, 1,5 g Yeast extrakt, 5 g pepton, 3,5 g NaCl, 3,68 g K2HPO4, 1,32 g KH2PO4, pH 7,2 (upravit 10M NaOH) autoklávovat 20 min. /121 °C

 

Kmeny použité v experimentu

    Fenotypové vlastnosti kmenů*

Donor

Escherichia coli HfrH Reich

tre+  leu+  pro+  ade+  thi_  strs

Recipient

Escherichia coli F_ 28R801

*auxotrofní mutanty pro esenciální aminokyseliny threonin, leucin, adenin, thimin; rezistentní / senzitivní k streptomycinu

Do recipientních buněk přechází segment tre+, leu+, pro+, ade+, thi-. Marker strS/R zůstává v endogenomu.

Obrázek 10. Složky minimálního agaru.
Schéma přípravy minimálního agaru pro konjugaci.

Příprava minimálního agaru (MA) pro konjugaci (Obr. 10):

Složka A: vodní agar 180 ml (vytemperovaný na 45°C)

Složka B: roztok solí 60 ml (vytemperovaný na 45°C)

Složka C: 20% glukóza

Složka D: streptomycin (výsl. konc. 100 µg/ml, zás. roztok 100 mg/ml )

Složka E: thyamin (výsl. konc. 5 µg/ml, zás. roztok 50 mg/ml)

Obrázek 11. Postup konjugace.

Postup:

  1. Zaočkovat kulturu donorového a recipientního kmene: naočkovat 1 kličku do 20 ml PNS média a inkubovat při 37 °C 18 hodin (do logaritmické fáze růstu).

  2. Smíchat kultury donorového a recipientního kmene v poměru 1 : 1 (5 ml + 5 ml) a inkubovat za aerace (při šetrném míchání na vodní lázni) při teplotě 37 °C / 3 hodiny.

  3. Stanovit titr donorového kmene HfrH rozsevem na plotny LBA ve zředění 10-5, 10-6, 10-7, vždy po 3 plotnách.
  4. Přesvědčit se, že ani kmen HfrH ani F- nerostou na selektivní půdě. Kontrolu provést výsevem po 0,1 ml kultury zředěné 10-1 na 3 plotny MA + streptomycin 100 μg/ml + thyamin 5 μg/ml. Ředění provádět ve fyziologickém roztoku!
  5. Po 3 hodinách inkubace vyset neředěnou konjugační směs na selekční půdu po 0,1 a 0,2 ml (vždy po 3 plotnách).


Literatura

Conjugation in Escherichia coli. Phornphisutthimas S., Thamchaipenet A., Panijpan B. (2007) Biochemistry and Molecular Biology Education 35 (6): 440-445, https://doi.org/10.1002/bmb.113

Developing an efficient and reproducible conjugation-based gene transfer system for bifidobacteria. Wilfredo Dominguez and Daniel J. O’Sullivan. (2013) Microbiology 159: 328–338. 

Bacterial conjugation. Griffiths A. J. F., Miller J. H., Suzuki D. T., et al. An Introduction to Genetic Analysis. 7th edition. New York: W. H. Freeman; 2000.


Předchozí
Následující