Bi7311: Praktikum z molekulární biologie prokaryot

Úloha: Příprava GTA a přenos rifampicinové rezistence do recipientního kmene Rhodobacter capsulatus


Cíl úlohy

Cílem úlohy je připravit filtrát obsahující GTA indukované z hostitelského kmene Rhodobacter capsulatus DE442 (Rif rezistentní, producent GTA) a prokázat přenos genu pro rezistenci k rifampicinu prostřednictvím GTA do recipientního kmene Rhodobacter capsulatus B10 (Rif citlivý).

Seznam materiálu

Bakteriální kmeny: Rhodobacter capsulatus DE442 (Rif rezistentní, producent GTA); Rhodobacter capsulatus B10 (Rif citlivý)

Média a material: Rifampicin, Petriho misky s YPS médiem s ATB a bez ATB, bakteriologické filtry 0.22 µm, sterilní skleněné zkumavky (15 ml)

RCV bujón/agar (objem 1 l; autoklávujeme): 4 g D, L- kyseliny jablečné; 1 g (NH4)2SO4; 10 mM pufr fosforečnanu draselného; 200 mg MgSO4.7H2O; 75 mg CaCl2.2H2O; 12 mg FeSO4.7H2O; 20 mg Na2EDTA; 1 ml roztoku stopových prvků; 1 mg thiamine hydrochloride (vitamín B1 hydrochlorid). pH upravit na 6.8 pomocí NaOH před autoklávováním. (pro agar přidat agar č. 1 – 1,5%)

Roztok stopových prvků (v 250ml dH2O): 0.7 g H3BO3 ; 398 mg MnSO4.H2O; 188 mg Na2MoO4.2H2O; 60 mg ZnSO4.7H2O; 10 mg Cu(NO3).3H2O

G pufr (sterilizovat filtrací): 10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM MgCl2; 1 mM CaCl2; 1 mM NaCl; 0.5 mg/ml Bovine Serum Albumin (BSA)

YPS médium (autoklávujeme): 0.3% yeast extract; 0.3% Bactopeptone;  2 mM CaCl2; 2 mM MgSO4; (pro agar přidat agar č. 2 do koncentrace 1 – 1,5%, pro selekci přidat Rifampicin do koncentrace 100μg/ml)

Postup:

A.Příprava filtrátu obsahujícího GTA

1.den

  1. Ráno naočkovat R. capsulatus DE442 do 20 ml RCV bujónu, inkubovat 28 h./ 35 °C /200 rpm.

2. den

  1. Přeočkovat 28 h. kulturu R. capsulatus DE442 do YPS media (1% celkového objemu).
  2. Naplnit sterilní skleněné zkumavky po vrch, pečlivě uzavřít a ujistit se, že uvnitř nejsou vzduchové bubliny, víčko zkumavek utěsnit parafilmem.
  3. Inkubovat stacionárně 65 h./35°C v osvětleném termostatu.

5. den

  1. Centrifugace 1 ml buněk (12 000g/2 min), kontrola absorbance supernatantu spektrometrem pro vlnové délky 750-950 nm, jako blank použít YPS medium. Při indukci GTA by měli být vidět dva píky (absorbance intracelulárních pigmentů, které jsou uvolňovány při buněčné lyzi indukované GTA) (Obr. 14).
  2. Centrifugace zbytku buněk (8000 g/30 min/4°C ), filtrace supernatantu bakteriologickými filtry 0,8 μm nebo 0,4 μm do normálních a následně filtrem 0,22 μm do sterilních zkumavek.
  3. Uchováváme ve 4°C.
Obrázek 14. Adsorpční spektrum intracelulárních pigmentů R. capsulatus.
Bakterie R. capsulatus při uvolnění GTA do prostředí produkuje intracelulární pigmenty určité vlnové délky, které slouží jako detekční marker GTA.

B. Přenos Rif rezistence do recipientního kmene prostřednictvím GTA

1.den

  1. Zaočkovat R. capsulatus B10 do 20 ml RCV bujónu, inkubovat 28 h. /35 °C/ 200 rpm.

2.den

  1. Centrifugovat 28 h. kulturu (6000 g/ 4 min) a resuspendovat v ½ objemu sterilního G pufru (pro 20 ml tedy v objemu 10 ml).

  2. Do skleněné zkumavky přidat 0,4 ml G pufru, 0,2 ml kultury a 0,1 ml filtrátu z Rhodobacter capsulatus DE442 (Rif rezistentní, producent GTA). Jako kontrolu spontánních mutant přidáme do další zkumavky místo filtrátu G pufr. Jako kontrolu kontaminace filtrátu přidáme do další zkumavky jenom 0,6 ml G pufru a 0,1 ml filtrátu. Pro kontrolu životaschopnosti buňek přidáme do další zkumavky 0,5 ml G pufru, 0,2 ml kultury a tuhle směs na konci protokolu vysejeme na YPS plotnu bez rifampicinu.

  3. Inkubovat směs 1 h. / 35°C / 150 rpm.

  4. K směsi přidat 0,9 ml RCV média a inkubovat další 3 hodiny.

  5. Centrifugovat 4 min. / 6000g ve 2 ml Eppendorf zkumavkách, pelet resuspendovat ve zbytku supernatantu a vyset na YPS petriho misky s rifampicinem (výsledná koncentrace 100 µg/ml)

  6. Inkubovat v 35°C / 2 – 3 dny


Literatura

One for All or All for One: Heterogeneous Expression and Host Cell Lysis Are Key to Gene Transfer Agent Activity in Rhodobacter capsulatus. Paul C., Fogg M., Alexander B., Westbye J., Beatty T. (2012), PLoS ONE 7(8): e43772.

Gene transfer agents: phage-like elements of genetic exchange. Lang A. S., Zhaxybayeva O., and Beatty J. T. (2012), Nat. Rev. Microbiol. 10(7): 472–482. doi:  10.1038/nrmicro2802.

Předchozí
Následující