Bakterie druhu Staphylococcus aureus patří mezi běžné humánní patogeny a jsou původcem širokého spektra akutních a chronických onemocnění. Většina rozdílů mezi kmeny S. aureus je způsobena přítomností mobilních genetických elementů, jako jsou plazmidy, bakteriofágy, ostrovy patogenity, transpozony a inzerční sekvence.

Kmeny použité v první části této úlohy (A.) patří mezi běžné laboratorní kmeny, lišící se obsahem profágů ve svých genomech. Na základě výsledků PFGE můžeme navzájem odlišit jednotlivé kmeny a identifikovat, kde v genomu došlo k začlenění profágů. Na základě změny počtu fragmentů či změny jejich velikosti v makrorestrikčním spektru je možné určit typ genetické změny v genomu studovaného kmene.

V druhé části úlohy (B.) ověříme na základě makrorestrikčních spekter úspěšnost transdukčního experimentu. Získané transduktanty mají makrorestrikční spektrum shodné s recipientním kmenem S. aureus RN4220. Jako kontroly použijeme donorový kmen S. aureus Jevons B a recipientní kmen S. aureus RN4220.

Postup:

1. den

1. Zaočkovat kulturu do 20 ml 2× YT média a inkubovat 18 h při 37 °C

2. den

1. Odebrat 10 ml kultury, přidat 100 μl 0,5 M EDTA a chladit kulturu 10 min. při 4 °C.
2. Centrifugovat 10 min. při 4°C a 4000 ot. / min.
3. Dvakrát promýt v 5 ml promývacího roztoku zchlazeného na ledu.
4. Naředit bakteriální kulturu promývacím roztokem na hodnotu optické hustoty OD600 = 0,2 – 0,3.
5. Centrifugovat 10 min. při 4°C a 4000 ot. / min., slít supernatant a odsát zbytky roztoku, tak, aby nedošlo k porušení peletu
6. Sediment resuspendovat ve 100 μl promývacího roztoku a přenést do mikrozkumavek.
   
7. Mikrozkumavky s bakteriální suspenzí postupně zahřívat 2‐3 min. na 55 °C.
   
8. K buněčné suspenzi přidat 10 μl lyzostafinu (zásobní koncentrace 0,5 mg/ml), přidat 110 μl 2% agarózy s nízkým bodem tání (roztok v 50 mM Tris-Cl, 5 mM EDTA, pH 8,0) předem vytemperované na 55 °C a pečlivě promíchat pipetou.
9. Suspenzi přepipetovat po 200 μl do komůrek tvořítka a uložit na 20‐30 min. do lednice.
10. Vzniklé agarózové bločky přenést do lyzační směsi, která obsahuje 1 ml lyzačního roztoku a 20 μl lyzostafinu (zásobní koncentrace 0,5 mg/ml), a inkubovat je za mírného třepání ve vodní lázni o teplotě 37°C pro dobu 2 až 3 hodin
    Poznámka

    Lyzační roztok připravujeme do skleněných zkumavek se šroubovacím uzávěrem. Jednotlivé roztoky dále jen vyměňujeme a s bločky nemanipulujeme. Pokud nedojde v tomto kroku k projasnění bločků, ponecháme lyzovat přes noc při 4 °C.

11. Lyzační směs vyměnit za směs deproteinizační, která obsahuje 1 ml deproteinizačního roztoku a 25 μl proteinázy K (zásobní koncentrace 20 mg/ml), a inkubovat bločky za mírného třepání ve vodní lázni o teplotě 55 °C po dobu 12 hodin (roztok vyměnit po šesti hodinách).
    
    Poznámka

    Předem vyhřát lázeň na 55°C.

3. den:

1. Bločky promýt alespoň 5× v 10 ml 1× TE pufru při 4 °C, TE pufr vyměňovat po 1,5 hodinách, průběžně chladit na 8 °C.
2. Bločky lze po důkladném promytí štěpit restrikční endonukleázou (nejčastěji štěpíme přes noc).
   
   Poznámka

   Nenaštěpené bločky je možné skladovat po dobu 1 roku v lednici (TE pufr vyměňovat jednou za měsíc).

Restrikční štěpení (postup)

• Pro restrikční štěpení uřízneme z bločku vzorek o velikosti cca 1×1×5 mm.
• S bločky manipulujeme sterilně pomocí nerezových špachtlí, které sterilizujeme v etanolu a následným ožíhnutím nad plamenem.
• Bločky řežeme pomocí ostrého skalpelu, nejlépe na sterilní Petriho misce, kterou si můžeme podložit tmavou podložkou pro lepší manipulaci.
• Vlastní štěpení:
  Do mikrozkumavky namíchat restrikční směs (na 1 vzorek: 10 μl 10× restrikčního pufru, 85 μl vody a 5‐10 U restrikčního enzymu). Inkubujeme při požadované teplotě několik hodin nebo přes noc.
  

4.‐5. den:

1. Vlastní provedení PFGE.