MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROKARYOT - cvičení podzim 2019 GTA, Transdukce Ivana Mašlaňová iva.maslanova@gmail.com Rhodobacter capsulatus Rhodobacter capsulatus Domain: Bacteria Phylum: Proteobacteria Class: Alphaproteobacteria Order: Rhodobacterales Family: Rhodobacteraceae Genus: Rhodobacter Species: R. capsulatus 8 proteinů, průměr hlavy 30 nm, bičík 30-50 nm. Nebyly identifikovány fágy příbuzné s GTA. Přenos je regulován bakteriálními geny, které indukují expresi strukturních genů GTA během specifické růstové fáze buněk GTA Bakteriální kmeny: Donor: Rhodobacter capsulatus DE442 (Rif rezistentní, producent GTA) Recipient: Rhodobacter capsulatus B10 (Rif citlivý) •1 ml buněk (12 000g/2 min), kontrola absorbance supernatantu spektrometrem pro vlnové délky 750-950 nm, jako blank použít YPS medium. Při indukci GTA by měli být vidět dva píky (absorbance intracelulárních pigmentů, které jsou uvolňovány při buněčné lyzi indukované GTA) • filtrace supernatantu bakteriologickými filtry 0,8 μm nebo 0,4 μm do normálních a následně filtrem 0,22 μm do sterilních zkumavek. - uvolnění intracelulárních pigmentů během buněčné lyze - uvolnění GTA •centrifugovat 28 h. recipientní kulturu (6000 g/ 4 min) a resuspendovat v ½ objemu sterilního G pufru (pro 20 ml tedy v objemu 10 ml) •do skleněné zkumavky přidat 0,4 ml G pufru, 0,2 ml kultury a 0,1 ml filtrátu z Rhodobacter capsulatus DE442 (Rif rezistentní, producent GTA). KONTROLY: 1. Kontrola spontánních mutant -0,5 ml G pufru, 0,2 ml recipientní kultury 2. Kontrola kontaminace filtrátu – 0,6 G pufru, 0,1 ml filtrátu 3. Kontrola životaschopnosti buněk – 0,5 ml G pufru, 0,2 ml recipientní kultury (vyset na YPS misky bez rifampicinu) 4. Pozitivní kontrola – 0,4 ml G pufru, 0,2 ml recipientní kultury, 0,1 ml filtrátu s GTA (provedeno pracovníky LMDM) •inkubovat směs 1 h. / 35°C / 150 rpm •k směsi přidat 0,9 ml RCV media a inkubovat další 3 hodiny. •centrifugovat 4 min. / 6000g ve 2 ml Eppendorf zkumavkách, pellet resuspendovat ve zbytku sepernatantu a vysét na YPS petriho misky s rifampicinem (výsl. koncentrace 100 µg/ml) •inkubovat ve 35°C/ 2 – 3 dny Transdukce Bakteriofágem zprostředkovaný HGT. Generalizovaná transdukce – defektní fágová částice sbaluje náhodnou část bakteriálního chromozomu. Specializovaná transdukce – SaPI Lyzogenní konverze – bakteriofág se integruje do chromozomu hostitelského kmene a poskytuje hostiteli nějakou „novou vlastnost“ – gen virulence apod. Úloha transdukce Indukce fága transdukce donorový kmen Jevons B recipientní kmen RN4220 recipientní kmen RN4220 a) selekce na MPA s kadmiem koncentrace Cd: 2,5×10-4 M b) selekce na MPA s tetracyclinem koncentrace tetracyclinu: 5ug/ml ϕJB Materiál:  Připravený fágový lyzát JB (cca 500ml), recipientní kmen RN4220.  MPA, soft agar, roztoky tetracyklinu, kadmia, citrátu sodného a roztok CaCl2.  Sterilní odměrný válec, kónické zkumavky (50ml), petriho misky, sada pipet, špičky, epinky, vodní třepací lázeň Donorový kmen Jevons B – v genomu dva různé plazmidy, tetracyclinový plazmid (pT181; 4,4 kb) a β-laktamázový plazmid s rezistencí ke kadmiu (28 kb) Bakteriofág фJB – fág sérologické skupiny B, morfotyp B1, dlouhý, nekontraktilní bičík Recipientní kmen – S. aureus RN4220, restrikčně-deficientní laboratorní kmen, citlivý k ATB, bezplazmidový kgJFBriF Postup transdukce 1ml recipientní kmen RN4220 1ml transdukující fág фJB Inkubace 37°C/ 25 min. + CaCl2 do transdukční směsi (1/10 celkového objemu) + 0,03M citrát sodný (1:1 k celkového objemu) Centrifugace 3000 rpm/10min./4°C. Pelet resuspendovat v 0,017M citrátu sodném a) misky s Cd b) misky s tet