MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKY MIKROORGANISMŮ Praktikum z molekulární biologie prokaryot (BÍ7311) Autoři Mgr. Ivana Mašlaňová, Ph.D. Mgr. Lucie Kuntova, Ph.D. Mgr. Adéla Indráková Mgr. Pavol Bárdy Obsah Úvod..............................................................................................................................................3 Obecné zásady bezpečnosti práce v mikrobiologické a molekulárně-biologické laboratoři...............4 Mutace a reparace.........................................................................................................................5 Úloha: Izolace spontánních mutant rezistentních ke streptomycínu metodou gradientních ploten.................................................................6 Transdukce...................................................................................................................................10 Úloha: Transdukce plazmidů do restrikčně-deficientního kmene S. aureus RN4220......................................................................................11 Konjugace - přenos F faktoru.......................................................................................................16 Úloha: Konjugace kmenů Escherichia coli Hfr a F.......................................................................................................................................17 Gene transfer agents....................................................................................................................20 Úloha: Příprava GTA a přenos rifampicinové rezistence do recipientního kmene Rhodobacter capsulatus......................................................21 Pulznígelová elektroforéza (PFGE)...............................................................................................24 Úloha: Izolace bakteriální DNA pro pulznígelovou elektroforézu a provedení pulznígelové elektroforézy...................................................25 Plazmidy......................................................................................................................................28 Úloha: Izolace plazmidové DNA z transduktant a elektroforéza plazmidů v agarózovém gelu......................................................................29 Úloha: Stanovení počtu kopií plazmidů (plasmid copy number - PCN) v buňce pomocí QPCR..........................................................................33 Polyvalentní bakteriofág a jeho endolysin....................................................................................40 Úloha: Setřih fágového endolyzinu...........................................................................................................................................................42 PRACOVNÍ LIST 1...........................................................................................................................47 Mutace....................................................................................................................................................................................................47 PRACOVNÍ LIST II..........................................................................................................................48 Transdukce a stanovení počtu kopiítransdukovaných plazmidů v buňce pomocí QPCR..................................................................................48 PRACOVNÍ LIST III.........................................................................................................................49 Konjugace................................................................................................................................................................................................49 PRACOVNÍ LIST IV.........................................................................................................................50 GTA.........................................................................................................................................................................................................50 PRACOVNÍ LIST V..........................................................................................................................51 pulznígelová elektroforéza (PFGE) ..........................................................................................................................................................51 PRACOVNÍ LIST VI.........................................................................................................................54 Plazmidy...................................................................................................................................................................................................54 PRACOVNÍ LIST VII........................................................................................................................57 Endolysin.................................................................................................................................................................................................57 Úvod Studium molekulární biologie prokaryot zásadně ovlivňuje humánní a veterinární medicínu i průmysl. V klinické praxi jsou poznatky tohoto oboru nezbytné pro úspěšnost léčby, která se stává stále obtížnější kvůli rostoucí rezistenci k antibiotikům vznikající v důsledku evoluce nových bakteriálních kmenů. V průmyslu jsou mikroorganizmy nezastupitelné v biotechnologických procesech potravinářského, chemického či farmaceutického průmyslu. Porozumění molekulárním mechanizmům u prokaryot umožňuje vytvářet nová léčiva, technologie či zefektivňovat současné postupy a ve svém důsledku vede ke zlepšení kvality života nás všech. Jak ukazuje poslední desetiletí výzkumu, evoluci prokaryot významně ovlivňuje horizontální přenos genů. V průběhu praktika se studenti seznámí s analýzami pro identifikaci změn v prokaryotických genomech vlivem mutací, horizontálního přenosu genů transdukcí, konjugací a transformací, což prakticky doplní náplň přednášek. Studenti pochopí mechanizmy evoluce prokaryot v praxi a získají přehled o technikách využitelných k manipulaci bakteriálních genomů. Obecné zásady bezpečnosti práce v mikrobiologické a molekulárné-biologické laboratoři Biologické riziko při práci v mikrobiologické a molekulárně-biologické laboratoři je spojeno se zvýšeným rizikem infekce pracovníků (studentů) organizmy, s nimiž manipulujeme. Důsledné dodržování pravidel a kontrola pracovních postupů má preventivní charakter. Všechny mikroorganizmy považujeme za potencionálně patogenní. Za biologický infekční materiál považujeme veškeré mikroorganizmy (bakterie, viry) a laboratorní materiál, který s nimi přišel do styku. 1. Vstup do laboratoře je povolen pouze pracovníkům a studentům účastnícím se daného praktika. 2. V laboratoři vykonáváme pouze úkony související s náplní a obsahem cvičení. 3. V laboratoři je zakázáno pít, jíst a kouřit. 4. Během cvičení používáme ochranné pracovní pomůcky (plášť, přezůvky). 5. V laboratoři je zakázáno otevírat okna, cirkulaci vzduchu zajišťuje klimatizace. 6. Před příchodem do laboratoře je vhodné seznámit se s obsahem cvičení. 7. Před započetím a po ukončení práce provedeme dezinfekci ploch a rukou vhodnými prostředky. 8. Na pracovní plochu nepatří osobní věci. Oblečení, batohy, tašky odkládáme v šatně. Hodinky, šperky (náramky, prsteny) jsou zakázány, mobilní telefony během praktika nepokládáme na pracovní plochu. 9. V laboratoři udržujeme pořádek a čistotu. Dekontaminaci pracoviště a přístrojů provádíme ihned po znečištění. 10. S mikroorganizmy pracujeme ve flow-boxech a s vhodnými ochrannými pomůckami (plášť, rukavice). 11. Kahany necháváme hořet pouze po dobu, kdy je užíváme. 12. Manipulace s tlakovými nádobami, centrifugami, autoklávy a přístroji je povolena pouze pod dozorem proškolené osoby (vyučující). 13. Použité sklo a zbytky mikrobiálních kultur odkládejte na určená místa. Veškerý kontaminovaný materiál je nutné sterilizovat nebo dezinfikovat vhodnými prostředky, případně vyhodit do nádob určených na nebezpečný odpad. 14. Dojde-li k náhodnému potřísnění pokožky infekčním materiálem nebo k poranění, oznamte tuto skutečnost vyučujícímu. Pokožku je nutné ošetřit vhodným dezinfekčním prostředkem. 15. Po ukončení práce je nutné uklidit a dekontaminovat pracovní plochu. Odchod z místnosti je povolen pouze se svolením vyučujícího. Mutace a reparace Mutantaje varianta daného kmene nebo druhu, u nichž je modifikován jeden nebo více znaků, přenášejících se do potomstva. Aby mohla být změna dědičná, musí dojít ke změnám na úrovni genetického materiálu (DNA, RNA). Mutanty bakteriálních kmenů jsou využívány v praxi ke studiu metabolických drah, způsobu regulace genové exprese a k přípravě laboratorních kmenů vhodných pro klonování. Příprava mutantních variant má značný význam pro přípravu průmyslově a zemědělsky využívaných bakteriálních kmenů, např. kmeny s nadprodukcí určitých látek (enzymů, mastných kyselin, vitamínů, antibiotik aj.) nebo kmenů vhodných k vakcinaci. Proces vedoucí ke vzniku nových variant daného bakteriálního kmene se označuje jako mutageneze. K mutagenezi lze použít chemické, fyzikální nebo biologické mutageny. Po působení mutageny je třeba ponechat bakterie růst, aby došlo k fenotypové expresi navozených změn v genetickém materiálu (DNA, RNA). Obvykle je mutován jen jeden řetězec DNA. Buňka tak obsahuje zásobu standardních genových produktů. Mutantní buňky proto vykazují fyziologicky normální fenotyp, dokud nedojde kvyředění produktů nemutovaných genů. Následnou replikací genomu dojde k separaci řetězce obsahujícího mutovanou variantu genu do dceřiných buněk. Prodleva v projevu mutantního fenotypu je označována jako fenotypové zdržení (lag). Tento jev můžeme sledovat u mutací navozujících rezistenci k antibiotikům (rifampicinu, streptomycínu aj.). Aby došlo k projevu rezistentního fenotypu, musí dojít k rozdělení buněk a expresi mutované varianty genu zodpovědné za navození rezistence. Vznikne-li mutace působením určitého fyzikálního nebo chemického faktoru, mluvíme o mutaci indukované. Pokud je vznik mutace náhodný, jedná se o mutaci spontánní. Tato mutace vzniká během některého z molekulárních procesů (replikace, transkripce, rekombinace, reparace) odehrávajících se v buňce bez působení vnějších faktorů. Molekulární podstata spontánních a indukovaných mutací je stejná (delece, inzerce nebo substituce nukleotidů). Frekvence spontánních mutací je podstatně nižší než u mutací indukovaných. Je důležité odlišovat mutaci od adaptace. Adaptace je schopnost organizmu přizpůsobit se danému prostředí. K adaptaci organizmů vlivem řady faktorů v prostředí dochází v delším časovém horizontu a proces adaptace je reverzibilní. Dědí se pouze schopnost organizmu adaptovat se na dané podmínky. Fluktuační test Cílem testu je prakticky prokázat, zda mutace vznikají v organizmu spontánně, nebo jako odpověď na vliv prostředí. Fluktuační test odpovídá na otázku, zda jsou mutace přítomny v organizmu před působením daným mutagenem, nebo vznikají v organizmech po vystavení tomuto faktoru. Tedy způsobem přirozeného výběru popsaným Darwinem, nebo jak se domníval Lamarck, že se organizmy přizpůsobují pouze díky okolnímu prostředí. Teoretické předpoklady fluktuačního testu: • Pravděpodobnost mutace je velmi nízká, ale stejná pro každou buňku (10-6-10-10). • Při fyziologické adaptaci reagují buňky na přítomnost látky v prostředí. Ta působí jako selekční faktor, který indukuje adaptivní odpověď (např. tvorbu enzymů apod.). Počet reagujících buněk v různých populacích je zhruba stejný. • Uvažujeme-li určitou kulturu pocházející z jedné buňky, pak na konci kultivace bude počet mutant odrážet dobu, ve které mutace vznikla (tj. ve které generaci). Vzhledem k nízké pravděpodobnosti mutace lze předpokládat, že i počty mutant v jednotlivých klonech budou rozděleny podle Poissonovy řady - to proto, že záleží na generaci, ve které k mutaci došlo. Proto se budou významně lišit počty mutant v jednotlivých kulturách a v kultuře, kde byly buňky pěstovány dohromady. Úloha: Izolace spontánních mutant rezistentních ke streptomycínu metodou gradientních ploten Cíl úlohy: Cílem úlohy je izolovat kolonie S. aureus rezistentní ke streptomycínu, které vznikly spontánní mutací u citlivého kmene S. aureus při inkubaci na gradientních plotnách. Seznam materiálu • 18-ti hodinové bakteriální kultury na MPA (kmeny Staphylococcus aureus citlivé ke streptomycínu). • Misky s 2% MPA, MPB na přípravu suspense bakteriální kultury. • MPA na gradientní plotny: 160 ml na podkladovou vrstvu, 4 x 50 ml MPA na různé koncentrace streptomycínu (zvlášť v Erlenmeyerových baňkách). • MPA (5 x 300 ml) na selekci spontánních mutant na plotnách s 5 různými koncentracemi antibiotika (připravují se vždy čerstvé až dle vyhodnocení nárůstu na gradientních plotnách). • Zásobní roztok streptomycínu (100 mg/ml). • Sterilní hokejky, sterilní Petriho misky, pipety a 25 ml pipety s upravenou špičkou, plastové špičky, sterilní párátka. Postup: A. Izolace spontánních mutant 1. den 1. Z 18-ti hodinové bakteriální kultury kultivované na MPA odebrat 5 kliček a resuspendovat ve 3 ml MPB. 2. Z připravené suspenze stanovit titr buněk (CFU/ml) rozsevem 100 ul z ředění 106, 107, 10s, od jednoho ředění provést vysev na 3 misky s MPA. Kultivace při 37°C/20 hod. 3. Připravit gradientní plotny se streptomycinem o výsledných koncentracích: 10, 50, 100 a 500 ug/ml. Zásobní roztok streptomycinu přidat do rozvařené MPA půdy, předem vytemperované na max. 55°C. 4. Provést rozsevy bakteriální suspense po 100 ul na gradientní plotny, 3 plotny od příslušné koncentrace (Obr. 1). 5. Kultivovat při 37°C/48 hod. 2. -3. den 1. Vyhodnocení nárůstu kultury na gradientních plotnách s antibiotikem. Jednotlivé kolonie za linií kompaktního nárůstu lze považovat za mutované bakterie (Obr. 2.). Spočítat všechny domnělé mutanty. Obr. 2. Nárůst kultury bakteriálního kmene na gradientní plotně Jednotlivé kolonie za zónou kompaktního nárůstu spočítat a přenést do MPB k přípravě suspenze buněk a přečárkování 2. Přečárkovat vybrané mutanty sterilním párátkem na MPA se streptomycinem o koncentracích 5, 10, 50, 100 a 500 ug/ml (Obr. 3). 3. Kultivovat při 37°C/20 hod. 4. Hodnotit izolované mutanty testovaného kmene S. aureus (Obr. 4). Obr. 3. Ověření necitlivosti mutant k antibiotiku 5|i(|/ml 10 na'ml 50(ig/ml 100ng/ml 500 jig/ml 5. Hodnotit izolované mutanty testovaného kmene S. aureus dle obr. 4. Obr. 4. Nárůst mutant S. aureus na MPA s antibiotikem B. výpočet frekvence spontánních mutací. Stanovit počet získaných mutant a určit frekvenci mutací k jednotlivým koncentracím streptomycínu. Výpočet mutačního indexu (F): F = Mu/N Mu - počet získaných mutant v 1 ml původní suspenze N - počet buněk v 1 ml původní suspenze C. Stanovení citlivosti kmenů ke streptomycínu 1. den 1. Stanovit citlivost kmenů k streptomycínu. Z připravené suspense testovaného kmene odebrat 100 ul a vyset přes 0,7% MPA vytemperovaný na 45°C na plotnu s 2% MPA. Po utuhnutí vykápnout antibiotikum (10, 50, 100 a 500 ug/ml) na povrch agarové plotny a po vsáknutí kultivovat při 37°C/20 hod. Jako kontrolu použít kmen S. at/ret/srezistentní ke streptomycínu. 2. den 1. Vyhodnotit test ověření citlivosti testovaného kmene k antibiotiku. Literatura: Methods in Molecular Biology (2016) 1373: 111-115, doi: 10.1007/7651_2014_190 An Introduction to Genetic Analysis. 7th edition. Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, et al. New York: W. H. Freeman; 2000. Spontaneous mutations. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21897/ Mechanisms of Streptomycin Resistance: Selection of Mutations in the 16S rRNA Gene Conferring Resistance. Springer B, Kidan YG, Prammananan T, Ellrott K, Bóttger EC, Sander P. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001;45(10):2877-2884. doi:10.1128/AAC45.10.2877-2884.2001. Transdukce Bakteriální genomy se vyznačují velkou genetickou variabilitou, která souvisí se schopností bakterií adaptovat se na měnící se podmínky prostředí. Vysoká adaptabilita a rychlá evoluce bakteriálních genomů je spojena s přežíváním bakterií pod neustálým selekčním tlakem, např. antimikrobiálních látek. Variabilita genomů je výsledkem spolupůsobení mutací genů a ziskem nebo ztrátou DNA. Akumulace mutací je pomalý proces, sám o sobě nedostačující k rychlé adaptaci bakteriálních populací. Hlavní evoluční sílu tak představuje horizontální přenos genů (HGT), zprostředkovaný několika mechanizmy: (a) transformací - přenos samotné DNA; (b) konjugací - přenos DNA zprostředkovaný přímým kontaktem buněk prostřednictvím pilusu; (c) transdukcí (Obr. 5) - přenos genetického materiálu v populaci bakteriálních buněk prostřednictvím virových částic (bakteriofágů). Obrázek 1: Transdukce. Transdukce zahrnuje několik kroků: (a) fág infikuje hostitelskou buňku, (b) fág se replikuje v hostiteli, (c) sestavování fágových virionů, některé viriony chybně sbalují i hostitelskou DNA - vznik transdukujících částic, (d) uvolnění fágového potomstva do prostředí. Bakteriofág Hostitelská (donorová buňka Bakteriální chromozom Fágová DNA Fágové částice s donorovou DNA Fág vpravuje DNA do buňky. Enzymy kódované f agovy m i geny degradují hostitelskou DNA Transdukující fág Recipientní buňka Sestavování nových virionů v hostitelské buňce Vznik transdukující ch virionů Transduktanta Transdukující O bakteriofág vpravuje DNA do recipienta — Donorová DNA je do chromozomu recipienta začleněna rekombinací. Copyright © 2006 Pearson Education. Inc.. publishing as Benjamin Cummings. Proces transdukce u rodu Staphylococcus je nejčastěji zprostředkován mírnými (temperovanými) fágy z řádu Caudovirales, čeledi Siphoviridae. V průběhu transdukce je genetický materiál začleněn do virionů bakteriofága a je přenesen do jiného mikroorganizmu. Transdukující fágová částice je stabilní, chráněna proteinovým obalem, proto se sbalená DNA šíří snadněji než volná DNA. Genetický materiál je chráněn před degradací hostitelskými restrikčními endonukleázami. Klíčovým krokem transdukce je sbalení DNA do virionu během lytického cyklu fága. Tento proces je vysoce specifický pro fágovou DNA. Při chybném sbalení může s frekvencí 10"4-10"8 dojít k začlenění bakteriální DNA (plazmidy, části chromozomu) do hlavy fága a přenesení segmentu DNA do nového hostitele. Transdukce může být obecná nebo specifická, podle specifity sbalování bakteriální DNA. Životní cyklus mírných fágů se skládá z lyzogenního a lytického cyklu. Během lytického cyklu dochází ke vzniku transdukujících částic (Obr. 1). Přechod bakteriofágů z lyzogenního do lytického cyklu může být v laboratorních podmínkách indukován různými chemickými nebo fyzikálními činidly (např. UV záření, mitomycin C, ciprofloxacin aj.) (Obr. 2). Obrázek 2: Vznik transdukujících fágových částic. Po indukci profága prostřednictvím UV záření dojde k uvolnění fágového potomstva. S různou frekvencí dochází ke vzniku transdukujících částic přenášejících části bakteriálního chromozomu. Úloha: Transdukce plazmidů do restrikčně-deficientního kmene 5. aureus RN4220 Cíl úlohy: Cílem úlohy je přenos plazmidů kódujících geny rezistence do bezplazmidového recipientního kmene S. aureus RN4220 prostřednictvím bakteriofága cjxlB (Obr. 3). Obrázek 3: Bakteriofág cbJB. Snímek z transmisního elektronového mikroskopu (TEM). V úloze se pracuje s bakteriofágem cbJB, který byl indukován UV zářením z donorového kmene S. aureus Jevons B. Tento donorový kmen obsahuje dva plazmidy (pT181, pHOUMR-like). Plazmid pT181 kóduje gen pro rezistenci k tetracyklínu, plazmid pHOUMR-like gen pro rezistenci k p-laktamovým antibiotikům a ke kadmiu. Úkolem bude připravit kmen RN4220 obsahující plazmid pT181 a dále kmen RN4220 s plazmidem pHOUMR-like (Schéma I). Schéma I. Přenos plazmidů pT181, pHOUMR-like do recipientního kmene RN4220 transdukcí. Po indukci bakteriofága z donorového kmene Jevons B dochází k uvolnění fágového potomstva. Transdukující lyzát je pomnožen na recipientním kmeni RN4220 a pomocí vhodných selekčních médií jsou selektovány buňky obsahující plazmidy s geny rezistence (transduktanty). C^^j^ ^ Indukce fága ^Jj^ ^ ^ .—» transdukce recipientní kmen RN4220 a) selekce na M PA s kadmiem koncentrace Cd: 2,5x1a-1 M -- transdukce donorový kmen /Ä\ O * ^--recipientní kmen Jevons B q>JB f ^ A RN4220 ^zZ^^ J b) selekcena MPA s tetracyclinem koncentrace tetracyclinu: 5ug/ml Seznam materiálu: • Připravený fágový lyzát cpJB (cca 500 ml), recipientní kmen 5. aureus RN4220. • MPA, 0,7% soft agar, roztoky tetracyklínu (5 mg/ml), kadmia Cd(N03)2 (0,01 M), citrátu sodného (0,1 M) a roztok CaCI2 (20 mM). • Sterilní odměrný válec, kónické zkumavky (50 ml), Petriho misky, sada pipet, špičky, Eppendorfovy mikrozkumavky, Wassermannovy zkumavky s kovovým kloboukem, vodní třepací lázeň Postup: Úloha zahrnuje několik dílčích kroků: A. transdukce plazmidů. B. stanovení titru recipientního kmene (CFU/ml) a titru fágového lyzátu (PFU/ml). C. výpočet frekvence transdukce. D. ověření přenosu plazmidových genů rezistence (tetKa blaZ) pomocí PCR E. ověření úspěšnosti transdukce pomocí pulznígelové elektroforézy (PFGE) A. transdukce plazmidů. 1. Zaočkovat recipientní kmen (20 u.1 zamražené kultury do 20 ml MPB) a inkubace 37 °C / 18 hod. 3. Přidat roztok CaCb (zás. roztok 20 mM) ke kultuře recipientního kmene do výsledné koncentrace 2 mM. 4. Smíchat 1 ml kultury recipienta s 1 ml transdukujícího fágového lyzátu tak, že hodnota multiplicity infekce (poměr počtu fágových částic k počtu buněk) bude max. 1. 5. Inkubovat transdukční směs při 37 °C / 25 min. za stálého třepání. 6. Přidat roztok citrátu sodného (zás. roztok 0,1 M) k transdukční směsi do výsledné koncentrace 15 mM, centrifugovat 3000 rpm / 10 min. / 4-8 °C a resuspendovat pelet v roztoku 17 mM citrátu sodného (objem pro resuspendaci závisí na počtu misek, na které se bude transdukční směs vysévat a na množství směsi vyseté na jednu misku (ideálně 100-300 u.1). 7. Vyset transdukční směs na misky s MPA obohaceným o citrát sodný (20 mM) a tetracyklín (5 u.g/ml) nebo kadmium (2,5.10"4M). 8. Inkubovat selekční misky s transdukční směsí při 37 °C / 24-48 hod. B. Stanovení titru recipientního kmene (CFU/ml) a titru fágového lyzátu (PFU/ml). Stanovení titru bakterií nebo fágových částic vychází z ověřeného předpokladu, že z 1 životaschopné buňky/fágové částice vyrůstá 1 kolonie/l plaka. Bakteriální kulturu nebo fágový lyzát je třeba ředit, aby se kolonie/plaky po nárůstu nepřekrývaly a šlo je spočítat. Titry se provádí na 3 miskách od každého ředění, aby se odhalila případná chyba v provedení, výsledné počty se zprůměrují. Výsledek se uvádí v CFU/ml (colony forming units) pro bakterie a v PFU/ml (plaque forming units) pro fágy. Postup stanovení titru recipientního kmene (CFU/ml): 1. naředit kulturu 10"3až 10"6 dle očekávaného výsledku. • ředit desítkovou řadou: do 900 u.1 bujónu 100 u.1 kultury, promíchat, vyměnit špičku a novou špičkou přenést 100 u.1 kultury do dalších 900 u.1 bujónu atd. • ředění do plastových mikrozkumavek a plastovými špičkami nebo do sterilních Wassermannových zkumavek a skleněnými pipetami. 2. do zkumavky s 0,7% měkkým masopeptonovým agarem vytemperovaným na 45 °C přidat 100 u.1 18-ti hod. bakteriální kultury příslušného ředění (10"3až 10~6). 3. od jednoho ředění provést výsev na 3 misky s MPA. 4. kultivovat 18 hod. / 37 °C, misky otočit dnem vzhůru (kondenzující voda). Postup stanovení titru fágového lyzátu (PFU/ml): 1. naředit fágový lyzát 10"3až 10"7 dle očekávaného výsledku. • ředit desítkovou řadou: do 900 u.1 bujónu 100 u.1 lyzátu, promíchat, vyměnit špičku a novou špičkou přenést 100 u.1 lyzátu do dalších 900 u.1 bujónu atd. • ředění do plastových mikrozkumavek a plastovými špičkami nebo do sterilních Wassermannových zkumavek a skleněnými pipetami (materiál zvolit na základě doporučení pro daného fága). 2. do zkumavky s 0,7% měkkým masopeptonovým agarem vytemperovaným na 47°C přidat 250 u.1 0,02 M CaCb, 100 u.1 18-ti hod. bakteriální kultury (titrační kmen pro daného fága), 100 u.1 lyzátu v příslušném ředění (10"3 až 10 "7). 3. od jednoho ředění provést výsev na 3 misky s MPA. 4. kultivovat 18 hod. / 37 °C, misky otočit dnem vzhůru. C. výpočet frekvence transdukce. Zjištění počtu kolonií transduktant na miskách a výpočet frekvence transdukce jako podíl počtu transduktant (CFU/ml - colony-forming units /1 ml) k počtu fágových částic v transdukujícím lyzátu (PFU/ml - plaque-forming units /1 ml). Titry bakteriální kultury a fágového lyzátu počítáme jako průměrné počty kolonií/plak na miskách příslušného ředění. Počty je nutné přepočítán na objem lml kultury/lyzátu. Frekvence transdukce: A = Y/p Y - teoretický počet transduktant na lml transdukční směsi p - počet virionů (PFU) transdukujícího fága v lml transdukční směsi A - frekvence transdukce = Y/p D. ověření přenosu plazmidových genů rezistence (tetK a cadD) pomocí PCR. Úspěšnost transdukce lze v prvním kroku ověřit přítomností genů rezistence v transduktantech pomocí jednoduché PCR. U transduktant selektovaných na plotnách s tetracyklinem zjišťujeme přítomnost genu tetK, u transduktant selektovaných na kadmiu přítomnost genu cadD. Seznam materiálu: • Přededem připravená plazmidová DNA: donorový kmen 5. aureus Jevons B, recipientní kmen 5. aureus RN 4220 • PCR reagencie: voda pro PCR, nukleotidy, DNA-polymeráza, MgCb • sada pipet, špičky, Eppendorfovy mikrozkumavky, cycler, vybavení pro provedení elektroforézy Postup: Nejprve zjistíme sekvenci obou plazmidů a genů ŕeŕK a cadD pomocí databáze NCBI. Zkontrolujeme sekvenci primerů, zda odpovídají sekvencím sledovaných genů. Název primeru tetK-F tetK-R cadD-F cadD-R Sekvence primeru TCGATAGGAACAGCAGTA CAGCAGATCCTACTCCTT G G ATATTA GG TTTATTG G GTT CGCCACAACTTGCTATCGTA Velikost produktu (bp) Reference 169 Ng era/., 2001 162 Varga etal., 2012 Reakční směs pro PCR mícháme dle doporučení výrobce (např. FasrStart PCR Master, Roche Diagnostics). Protokol PCR: Počáteční denaturace 94°C/4 min Amplifikace (30 cyklů) 94°C/30 s 55 °C/30 s 72 °C/4 min Závěrečná extenze 72°C/4 min Literatura: Efficient plasmid transduction to Staphylococcus aureus strains insensitive to the lytic action of transducing phage. Mašlaňová I, Stříbná S, Doškář J, Pantůček R. FEMS Microbiology Letters 2016; 363(19): fnw211, doi:10.1093/femsle/fnw211. Molecular characterisation of a new efficiently transducing bacteriophage identified in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Varga M, Pantůček R, Růžičková V, Doškář J. Journal of General Virology 2016; 97(l):258-268. Phage transduction. Shan G., Roberts A., Mullany P. (eds) Clostridium difficile. Methods in Molecular Biology, 2016, vol 1476. Humana Press, New York, NY, doi.org/10.1007/978-l-4939-6361-4_13. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus. Olson M.E. In: Bose J. (eds) The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods in Molecular Biology, 2014, vol 1373. Humana Press, New York, NY Bacteriophages of Staphylococcus aureus efficiently package various bacterial genes and mobile genetic elements including SCCmecwith different frequencies. Mašlaňová I, Doškář J, Varga M, Kuntova L, Mužík J, Malúšková D, Růžičková V, Pantůček R. Env Microbiol Reports 2013; 5(l):66-73. Konjugace - přenos F faktoru Konjugace je proces, při kterém je DNA přenášena z donorové buňky do recipientní v důsledku kontaktu buněk a vytvoření konjugačního můstku (Obr. 4). Uskutečnění konjugace lze dokázat vznikem rekombinantů, které nemohly vzniknout jinak, než rekombinací mezi genomem donorového a recipientního kmene. Konjugace u E. coli je závislá na přítomnosti a stavu F faktoru. F je plazmid (94,5 kb), který se může autonomně replikovat v buňce nebo integrovat do hostitelského chromozómu. Podle stavu F faktoru se označují příslušné kmeny: Označení F F+ Stav F faktoru F faktor není přítomen v buňce F faktor je přítomen v cytoplazmě Vlastnosti Vhodný recipient během konjugace. Může být přenášen konjugací do recipientní buňky; přenos chromozomálních genů může zprostředkovat při velmi nízké frekvenci. F F faktor nese segment bakteriálního chromozomu Může být přenášen spolu s asociovaným bakteriálním segmentem chromozómu; může zprostředkovat přenos chromozomálních genů při střední frekvenci v důsledku integrace do chromozómu v homologických oblastech Hfr F faktor je integrován do bakteriálního chromozomu Může přenášet chromozomální znaky při vysoké frekvenci (od pevného bodu na chromozómu, který je charakteristický pro každý Hfr) Obrázek 4: Konjugace u E. coli. (1) Donorová buňka vytváří pilus, kterým kontaktuje recipientní buňku. (2) Dochází k vytvoření póru mezi oběma buňkami. (3) Jeden plazmidový řetězec přechází do dceřinné buňky. (4) Dosyntetizování komplementárního plazmidového řetězce v donorové I recipientní buňce - vzik F+ buněk. F plazmid konjugační můstek bakteriální chromozom F+ buňka F+ buňka Úloha: Konjugace kmenů Escherichia coli Hfr a F Cíl úlohy: Cílem úlohy je stanovit frekvenci konjugace mezi donorovým kmenem E. coli HfrH Reich a E. coli F 28R801, ověřit vznik transkonjugant. Pozorování změny fenotypových vlastností transkonjugant. Kmeny použité v experimentu Fenotypové vlastnosti kmenů* Donor Escherichia coli HfrH Reich tre+ |eu+ pro+ aC|e+ thi~ strS Recipient Escherichia coli F~ 28R801 tre- leu- pro- ade- tni- strr *auxotrofní mutanty pro esenciální aminokyseliny threonin, leucin, adenin, thimin; rezistentní / senzitivní k streptomycinu Do recipientních buněk přechází segment tre , leu , pro , ade , thí'. Marker str5'* zůstává v endogenomu. Seznam materiálu: Bakteriální kmeny: Escherichia coli HfrH Reich, Escherichia coli F~ 28R801 Média a materiál: • Sterilní laboratorní sklo - Erlenmayerovi baňky 250 ml, 100 ml, 50 ml, 25 ml, petriho misky Minimální agar: míchá se ze složek A+B+C+D+E A. vodní agar: 3,96g agaru č. 3 do 180 ml dH2 15 kb), které jsou citlivé na poškození, by měly být izolovány metodou minimalizující působení fyzikálních sil (lyže dodecylsulfátem sodným). Pro malé plazmidy je možné použít více metod. (c) Oddělení plazmidové DNA od ostatních vysoko a nízkomolekulárních komponent. Po přidání EDTA a v některých případech lyzačních enzymů jsou buňky vystaveny působení detergentu a lyžovány varem nebo alkalicky. To způsobí denaturaci chromozomální DNA, která je obvykle již ve formě lineárních fragmentů a během renaturace se spojí se zbytky lyžovaných buněk a rychle klesá při centrifugaci na dno zkumavky. Naproti tomu vlákna plazmidové DNA, tvořená kovalentně uzavřenými molekulami se při denaturaci nerozcházejí, protože jsou v důsledku nadšrubovicové struktury vzájemně propletená a mohou na rozdíl od lineárních fragmentů rychle renaturovat. Lyže varem není doporučována při izolaci z kmenů produkujících endonukleázu A. Endonukleáza A není varem kompletně inaktivována a plazmidová DNA může být degradována během následných inkubací za přítomnosti Mg2+. Tomuto problému lze předejít zařazením extrakce s fenol-chloroformem. (d) Purifikace plazmidové DNA a stanovení koncentrace a čistoty. Proteiny odstraňujeme extrakcí směsí fenol-chloroform. Precipitaci DNA provádíme 96 % ethanolem po přidání jednomocných iontů. Odstranění RNA provádíme působením pankreatickou RNázou. Vysoce čisté kovalentně uzavřené kružnicové DNA je možné získat po centrifugaci v gradientu CsCI-ethidium bromid. Z dalčích metod je možné použít pro purifikaci plazmidové DNA precipitaci polyetylén glykolem, chromatografii a komerční metody využívající adsorpci na silikagelovou kolonku. Obecně během izolačních postupů je třeba dodržovat následující zásady: Správně volit iontovou sílu extrakčního a purifikačního roztoku a udržovat ji v průběhu celého experimentu. Udržovat optimální hodnotu pH prostředí (většinou neutrální, tj. pH 7,0 až 7,5). Výrazně vyšší nebo nižší hodnoty pH způsobují denaturaci DNA. Zabránit působení nukleáz, tj. enzymů, které degradují nukleové kyseliny: To lze docílit: (a) prováděním izolace při nízkých teplotách (b) přidáním inhibitorů nukleáz (např. EDTA, citronan sodný aj.) (c) zabráněním exogénni kontaminace mikroflórou, tzn. pracovat se sterilním materiálem Úloha: Izolace plazmidové DNA z transduktant a elektroforéza plazmidů v agarózovém gelu Cíl úlohy: Cílem úlohy je izolace plazmidů z transduktant, donorového a recipientního kmene pro jejjich pozdější kvantifikaci pomocí qPCR. Seznam materiálu: • 18-ti hodinové bakteriální kultury (donorový kmen Jevons B, transduktanty) • Komerční kity pro izolaci plazmidové DNA (pro PCR, klonování, sekvenování, in vitro transkripce): High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) nebo NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel) • Plastové špičky, pipety, mikrozkumavky, PBS, lyzostafin, kónické 15 ml zkumavky. • SERVA agaróza, elektroforetická vana a příslušenství, velikostní marker. A. Izolace plazmidové DNA Kit je určen pro izolaci plazmidové DNA metodou založenou na alkalické lyži u E. coli a s níže uvedenou modifikaci u druhu S. aureus. Postup: 1. den 1. Naočkovat stafylokokovou bakteriální kulturu s příslušným plazmidem, inkubovat 18h/37 °C ve 20 ml MPB. 2. den Pracujeme v laminárním boxu, sterilně 1. Centrifugovat cca 7 ml bakteriální kultury při 4500 rpm/15 min. 2. Odstranit supernatant, promýt v 5 ml PBS, resuspendovat pelet. 3. Centrifugovat při 4500 rpm/15 min., odstranit veškerý supernatant. 4. Připravit lyzační směs: 235 u.1 suspenzní pufr (součást kitu: Roche roztok č. 1, Macherey-Nagel roztok AI), 15 u.1 lyzostafinu. 5. Pelet důkladně resuspendovat v předem připravené lyzační směsi (250 u.1), přepipetovat do Eppendorfovy mikrozkumavky a inkubovat při 37 °C do lyže buněk (projasnění, zvýšení viskozity) cca 30 min. - 2 h. Pracujeme na stole podle návodu výrobce kitu 6. Přidat 250 u.1 lyzačního pufru (Roche roztok č. 2, Macherey-Nagel roztok A2), promíchat pomalým převracením zkumavky, inkubovat 5 min/pokojová teplota. 7. Přidat 250 u.1 (roztok č. 3, Roche) nebo 300 u.1 (roztok A3, Macherey-Nagel) vazebného pufru. U kitu Roche inkubovat na ledu 5 min a roztok č. 3 předem vychladit. Zkumavku opatrně promíchat, abychom dosáhli co nejvyšší výtěžek plazmidové DNA bez chromozomální DNA. 8. Centrifugovat 10 min při max. otáčkách. 9. Supernatant přenést na filtr kolonky umístěné do sběrné zkumavky. Navázání DNA na filtr centrifugací max. rpm/1 min. 10. Promývat DNA podle doporučení výrobce kitu. Roche: 500 u.1 roztok č. 4, centrifugovat při max. rpm/1 min; 700 u.1 roztok č. 5, centrifugovat při max. rpm/1 min (dvakrát po sobě, odstranění veškerého roztoku) Macherey-Nagel: 450 u.1 pufru AQ, centrifugovat při max. rpm/3 min (odstranění veškerého roztoku). 11. Eluovat DNA. Opatrně odstranit sběrnou zkumavku a umístit kolonku do sterilní mikrozkumavky pro uchování DNA. Roche: napipetovat na střed filtru 50-100 u.1 elučního pufru, centrifugovat při max. rpm/1 min, pro vyšší výtěžek eluční pufr zahřát na 60 °C a nechat stát 10 min. při lab. teplotě. Macherey-Nagel: napipetovat na střed foltru 50 u.1 elučního pufru AE, inkubovat 1 min. při laboratorní teplotě, centrifugovat při max. rpm/1 min. 12. Stanovit čistotu a koncentraci DNA. 13. DNA uchovávat v mikrozkumavkách při -20 °C. B. Elektroforéza (ELFO) v agarózovém gelu Fragmenty nukleových kyselin lze dle jejich velikosti rozdělit elektroforézou (Obr. 9). Elektroforéza využívá rozdílné pohyblivosti jednotlivých fragmentů danou právě jejich rozdílnou velikostí. Nukleová kyselina nese díky záporně nabitým fosfátům záporný náboj, a proto se v elektrickém poli pohybuje od záporného pólu (katody) ke kladnému (anodě). ELFO je jedna ze separačních technik využívaná při izolaci a analýze nukleových kyselin. Principem ELFO separace je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou negativně nabité fosfátové skupiny, a proto se nukleové kyseliny v elektrickém poli pohybují k opačně nabité elektrodě - anodě. Rychlost pohybu molekul DNA v gelu (elektroforetická pohyblivost) je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Konvenční elektroforézou v agarózovém gelu lze separovat molekuly nukleových kyselin o velikosti od 100 bp do cca 50 kb. Gely o nižší hustotě (0,7-1,2 % agaróza) jsou používány k separaci velkých fragmentů (tisíce bází), gely o vyšší hustotě (1,5-3 % agaróza) jsou používány k separaci malých fragmentů (stovky až desítky bazí). Standardně se používá napětí 5 - 8 V/cm. Molekuly nukleových kyselin v gelu je nutné vizualizovat barvením. Nejčastěji je používán etidiumbromid, který se vmezeřuje mezi sousední páry bází v DNA (resp. RNA) a vytváří s nimi komplex, který po osvětlení UV světlem červeně fluoreskuje. Obr. 9: Schématické znázornění rozdělení DNA pomocí metody ELFO směs fragmentů DNA různé velikosti elektroforetický gel > (Tí > dlouhé fragmenty krátké fragmenty Postup: 1. Navážit potřebné množství (podle požadované hustoty gelu) agarózy SERVA do nádoby o vhodném objemu • použité sklo musí být čisté, nesmí obsahovat zbytky mycího prostředku 2. Přidat potřebné množství lxTAE pufru • nejlépe použít pufr ze stejné várky ředění jako bude v ELFO vaně, aby byl zajištěn shodný obsah iontů a tím stejnoměrné vedení elektrického napětí během ELFO • lxTAE se připravuje ředěním ze zásobního 50x koncentrovaného roztoku TAE. • Potřebný objem přidávaného lxTAE pufru zjistíme následujícím výpočtem: V = šířka gelu x délka gelu x výška gelu (vždy 0,5 cm) 3. Agarózu rozpuštěnou v lxTAE pufru rozvařujeme opatrně v mikrovlnné troubě (1-3 min. podle výkonu zvoleného spotřebiče) • agarózový gel opatrně promícháme (pozor na utajený var) • nechat vytemperovat na 55 °C • nalít do připravené formy, která je vyvážená pomocí vodováhy do roviny 4. lxTAE pufr v ELFO vanách je nutno vyměňovat po cca 4 cyklech běžné délky (1-2 h) nebo po každém dlouhém cyklu (3 h a více) 5. Nanášení vzorků: • k vzorku, který chceme nanášet na připravený gel přidáme malé množství nanášecícho pufru, na gel nanášíme cca lOu.1 vzorku s nanášecím pufrem, nezapomínáme na pozitivní a negativní kontroly a velikostní standard. • optimální velikost elektrického napětí při elektroforéze se udává jako 5-8 V/cm 6. Gel barvíme cca 30 min v lázni s ethidiumbromidem o konc. 1 u.g/ml (zás. roztok 10 mg/ml) tj. 60 u.1 EtBr do 600 ml lxTAE. 7. Nabarvený gel opláchnout v destilované vodě. Focení gelu. Pozn: Veškerou práci s EtBr je nutno provádět v NITRILOVÝCH RUKAVICÍCH!!! Pokud dojde ke kontaminaci EtBr, je nutné tuto plochu ošetřit dekontaminačním roztokem. Obr. 10: Výsledky izolace plazmidové DNA z transduktant A: selekce transduktant na tetracykllinu B: selekce transduktant na kadmiu M - velikostní standard (DNA Marker III); JB - donorový kmen Jevons B; 1-5 - transduktanty selektované na tetracyklínu (plazmid 4,4 kbp), 6-10 - transduktanty selektované na kadmiu (plazmid 28 kbp) C. Konformace plazmidové DNA a její mobilita v agarózovém gelu Molekula plazmidové DNA se v buňkách přirozeně vyskytuje v superhelikální formě (jinak označováno CCC forma nebo také forma I). Tato uzavřená cirkulární forma však díky zlomům konvertuje na otevřenou cirkulární formu (OC nebo také forma II), která je spolu s relaxovanou formou plazmidu stabilnější (Obr.l). Zlomy mohou být způsobeny mechanickým poškozením při manipulaci se vzorkem během izolace nebo působením endonukleáz štěpících superhelikální DNA (např. DNA-áza I). V nativní buňce o formě plazmidu rozhodují enzymy označované jako DNA gyrázy, které za spotřeby energie z ATP zavádějí superhelikální smyčky do plazmidové DNA a enzymy navozující relaxovaný stav (relaxázy). Během replikace se mohou vytvářet formy obsahující více než jednu molekulu stejné plazmidové DNA. Nejčastěji jsou vytvářeny dimery nebo trimery. Obrázek 1.:Topoizomerní formy plazmidů. □ iled r, single-stranded Jednotlivé formy pak během elektroforézy na agarózovém gelu migrují různou rychlostí, přičemž nejrychleji se pohybuje nejvíce kondenzovaná a tudíž nejmenší CCC forma. Elektroforetická mobilita od nejnižší po nejvyšší: • Štěpená, otevřená cirkulární forma (nicked): štěpena v jednom z řetězců DNA - NEJPOMALEJŠÍ • Lineární forma (linear): linearizovaná forma, vznik rozštěpením obou řetězců. • Uvolněná cirkulární forma (relax circular): oba řetězce DNA jsou neštěpené, k relaxaci dochází enzymaticky • Superspiralizovaná denaturovaná forma (supercoiled denatured): jedná se o spiralizovanou formu, která je ale méně kompaktní tím, že některé oblasti molekuly jsou nespárovány • Superspiralizovaná forma (supercoiled): spiralizovaná neštěpená, kruhová molekula - NEJ RYCHLEJŠÍ Obrázek 2.:Topoizomerní formy plazmidů a jejich elektroforetická mobilita. Restriction endonuclease- Direction of DNA migration Úloha: Stanovení počtu kopií plazmidů (plasmid copy number- PCN) v buňce pomocí QPCR Cíl úlohy: Stanovit počet kopií penicilinázového a tetracyklinového plazmidu u transduktant, kmene S. aureus Jevon B a kmene RN 4220 na bakteriální buňku pomocí QPCR. Absolutní kvantifikací stanovíme počet kopií genu blaZ , tetK lokalizovaného na plazmidu a bakteriálního genu SAU lokalizovaného v jedné kopii na bakteriálním chromozomu. Přesný počet plazmidů na buňku (PCN) stanovíme podle vztahu: velikost chromozomílní DNA [bp] Xmnožství plazmidové DNA \pa] PCN =----- velikost plazmidové DNA [bp] X množství chromozomíltú DNA [pg] Přesný postup: Lee CL - Ow D.S. - Oh S.K. Quantitative real-time polymerase chain reaction for determination of plasmid copy number in bacteria. J Microbiol Methods, 2006, 65: 258-267. LEE C et al. Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number in Escherichia coli. J Biotechnol., 2006, 123: 273-280. Seznam materiálu: • Celogenomová bakteriální DNA pro přípravu kalibrační přímky, desítkové ředění od 100 ng do 0,1 pg (1. Skupina). Kvantifikace bakteriálního genu SAU lokalizovaného na bakteriálním chromozomu. • Plazmidová DNA pro přípravu kalibrační přímky, desítkové ředění od 100 ng do 0,1 pg (2. skupina). Kvantifikace plazmidového genu blaZ nebo tetK v závislosti na typu kvantifikovaného plazmidu (pT181 nebo pUSA300-HOUMR-like). • DNA neznámých vzorků. • LightCycIer® 480 SYBR Green I Master (protokol na stránkách výrobce https://pim-eservices.roche.com/LifeScience/Document/c5c29b3a-97ed-e311-98al-00215a9b0ba8) • RT-PCR grade water Pro qPCR je používán přístroj značky Roche - Light Cycler 480 II. Všechny reakce jsou připravovány v triplikátech v optických 96-jamkových destičkách. Reakční směs je připravována v objemu 10 u.1 a obsahuje 5 u.1 2x konc. Master Mix (Roche), primery o výsledné koncentraci 300 u.M, příslušnou DNA v celkovém objemu 1,25 u.1. Standardní řada pro qPCR je připravena 10-ti násobným ředěním plazmidové a celogenomové DNA. Standardní ředící řady jsou ideálně připravovány ze zásobních vzorků celogenomové DNA a jsou skladovány při -20°C. Postup: 1. Izolace plazmidové a celogenomové DNA pro přípravu kalibrační přímky. 2. Izolace celogenomové DNA neznámých vzorků (transduktant). 3. Příprava kalibračních řad: Tři různé kalibrační přímky: I. skupina (Tab.l): - kalibrační přímka z celogenomové bakteriální DNA (kmen Jevons B) pro stanovení počtu kopií genu SAU, ředění připravit v koncentracích: 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg a 0,1 pg - kalibrační přímka bude mít celkem sedm datových bodů a každé ředění bude pipetováno na 96-jamkovou destičku v triplikátu (př. 100 ng - jamky A1-A3) - z důvodů stanovení průměrné hodnoty Q a standardní odchylky. II. skupina (Tab.ll): - kalibrační přímka z plazmidové bakteriální DNA (kmen Jevons B) pro stanovení počtu kopií genu blaZ, ředění připravit v koncentracích: 30 ng, 3 ng, 0,3 ng, 30 pg, 3 pg, 0,3 pg a 0,03 pg - kalibrační přímka bude mít celkem sedm datových bodů a každé ředění bude pipetováno na 96-jamkovou destičku v triplikátu (př. 30 ng - jamky A1-A3) - z důvodů stanovení průměrné hodnoty Q a standardní odchylky. III. skupina (Tab.lll): - kalibrační přímka z plazmidové bakteriální DNA (kmen Jevons B) pro stanovení počtu kopií genu tetK, ředění připravit v koncentracích: 30 ng, 3 ng, 0,3 ng, 30 pg, 3 pg, 0,3 pg a 0,03 pg - kalibrační přímka bude mít celkem sedm datových bodů a každé ředění bude pipetováno na 96-jamkovou destičku v triplikátu (př. 30 ng - jamky A1-A3) - z důvodů stanovení průměrné hodnoty Q a standardní odchylky. Pozn.: Pracovat ideálně ve třech skupinách, každá skupina připraví jednu reakční směs a jednu kalibrační přímku. Skupina I a II napipetuje jednu destičku dohromady, skupina III (gen tetK) napipetuje destičku zvlášť. 4. Připravit Master Mix: lx ...X SYBR Green 1 Master 5 Primer R (5uM) 0,75 Primer F (5uM) 0,75 PCR voda 2,25 DNA 1,25 Celkem 10 5. Do jamek na 96 jamkové destičce pipetovat 8,75 ul takto připraveného mastermixu (triplikáty viz Tab. I, II a III). 6. Do jamek dle Tab. I, II a III napipetovat DNA kalibrační přímky a neznámých vzorků (1,25 ul/jamka). Pracovat rychle, reagencie chladíme na ledu, destičku nevystavujeme zbytečně dlouho přímému světlu. 7. Do jamek označených jako „non template" pipetujeme pouze vodu - slouží jako negativní kontrola. 8. Provést Q.PCR, po skončení běhu stanovit Treshold a jednotlivé Q.. Pozn.: V tabulce IV vidíte vzorové výsledky, koncentrace DNA jsou přepočítány na log hodnoty, je třeba též započítat objem DNA, který dáváte do reakce. Grafl ukazuje, jak by měl vypadat finální výstup v protokolu. 40x Program reakce: I. Iniciační denaturační krok : 95°C/10 min. II. 95°C/15s III. 60°C/45s IV. disociační krok: 95°C/15 s; 60°C/60 s; 95°C/15 s; 60°C/15 s 9. Vypočítat účinnost PCR z grafu: hodnoty log. ředění vs. průměrné hodnoty Q , zjistit E, E%, R2, směrnici přímky (k) - vzor viz Tab. III, Graf I. Dle vzorců: Výpočet efektivity reakce (E) y=ax+b; kde a=k Směrnice (k)= -Log (E+l) E=101/k E[%]= (E-l)xlOO Stanovení PCN - výpočty do protokolu Z dat uvedených v pdf souborech, které exportujete po dokončení reakce: 1. Vytvořte graf závislosti log koncentrace na Cp standardu a neznámých vzorků - proložte datové body regresní přímkou a vypočítejte rovnici přímky a R2 pro oba běhy (kvantifikace genu blaZ nebo tetK a genu SAU) do jednoho grafu - vypočítejte a uveďte efektivitu obou běhů v % - zdůvodněte proč je hodnota E menší případně větší než 100% - srovnejte svoje výpočty s výsledky uvedenými v pdf souborech 2. Vypočítejte hodnoty PCN pro oba neznámé vzorky podle vztahu uvedeného v zadání úlohy Tabulka I: Příprava kalibrační přímky pro gen SAU Kalibrační přímka pro primery SAU1 a SAU2 (300 nM, 300 nM) celogenomová DNA Jevons B Wells Master Mix Forward primer 5uM Reverse primer 5uM Koncentrace DNA Templát PCR voda Konečný objem A1-A3 5 0,75 0,75 100 ng 1,25 2,25 10 A4-A6 5 0,75 0,75 10 ng 1,25 2,25 10 A7-A9 5 0,75 0,75 lng 1,25 2,25 10 A10-A12 5 0,75 0,75 0,1 ng 1,25 2,25 10 B1-B3 5 0,75 0,75 0,01 ng 1,25 2,25 10 B4-B6 5 0,75 0,75 0,001 ng 1,25 2,25 10 B7-B9 5 0,75 0,75 0,0001 ng 1,25 2,25 10 počet vzorků Master Mix F primer R primer PCR voda ul celogenomová DNA Vzorek Wells Master Mix Forward primer 5uM Reverse primer 5uM Koncentrace DNA Templát PCR voda Konečný objem Transdukta C1-C3 5 0,75 0,75 10 ng 1,25 2,25 10 Transdukta C4-C6 5 0,75 0,75 lng 1,25 2,25 10 Transdukta C7-C9 5 0,75 0,75 10 ng 1,25 2,25 10 Transdukta C10-C12 5 0,75 0,75 lng 1,25 2,25 10 Bez tem. D1-D3 5 0,75 0,75 - 0 3,5 10 Tabulka II: Příprava kalibrační přímky pro gen blaZ Kalibrační přímka pro primery blaZ-F a blaZ-R (300 nM, 300 nM) plazmidové DNA 5. aureus Jevons B Wells Master Mix Forwa rd prime r 5\iM Reverse primer 5\iM Koncentrace DNA Templát PCR voda Konečný objem počet částic přepočet D4-D6 5 0,75 0,75 30 ng 1,25 2,25 10 D7-D9 5 0,75 0,75 3 ng 1,25 2,25 10 D10-D12 5 0,75 0,75 0,3 ng 1,25 2,25 10 E1-E3 5 0,75 0,75 0,03 ng 1,25 2,25 10 E4-E6 5 0,75 0,75 0,003 ng 1,25 2,25 10 E7-E9 5 0,75 0,75 0,0003 ng 1,25 2,25 10 E10-E12 5 0,75 0,75 0,00003 ng 1,25 2,25 10 počet vzorků Master Mix F primer R primer PCR voda Ul celogenomová DNA z transduktant {blaZ) Vzorek Wells Maste r Mix Forward primer 5\iM Reverse primer 5p.M Koncentrace DNA Templát PCR voda Konečný objem Transduktanta 1 F1-F3 5 0,75 0,75 10 ng 1,25 2,25 10 Transduktanta 1 F4-F6 5 0,75 0,75 lng 1,25 2,25 10 Transduktanta II F7-F9 5 0,75 0,75 10 ng 1,25 2,25 10 Transduktanta II F10-F12 5 0,75 0,75 lng 1,25 2,25 10 Bez tem. G1-G3 5 0,75 0,75 - 0 3,5 10 Tabulka III: Příprava kalibrační přímky pro gen tetK (na zvláštní destičku) Kalibrační přímka pro primery tetK-F a tetK-R (300 nM, 300 nM) plazmidové DNA 5. aureus Jevons B Wells Master Mix Forward primer 5\iM Reverse primer 5\iM Koncentrace DNA Tem plát PCR voda Konečný objem počet částic přepočet A1-A3 5 0,75 0,75 30 ng 1,25 2,25 10 A4-A6 5 0,75 0,75 3 ng 1,25 2,25 10 A7-A9 5 0,75 0,75 0,3 ng 1,25 2,25 10 A10-A12 5 0,75 0,75 0,03 ng 1,25 2,25 10 B1-B3 5 0,75 0,75 0,003 ng 1,25 2,25 10 B4-B6 5 0,75 0,75 0,0003 ng 1,25 2,25 10 B7-B9 5 0,75 0,75 0,00003 ng 1,25 2,25 10 počet Master F R PCR vzorků Mix primer primer voda Ul celogenomová DNA z transduktant (tetK) Vzorek Wells Master Mix Forward primer 5\iM Reverse primer 5p.M Koncentrace DNA Tem plát PCR voda Konečný objem Transduktanta 1 C1-C3 5 0,75 0,75 10 ng 1,25 2,25 10 Transduktanta 1 C4-C6 5 0,75 0,75 1 ng 1,25 2,25 10 Transduktanta II C7-C9 5 0,75 0,75 10 ng 1,25 2,25 10 Transduktanta II C10- 5 0,75 0,75 1 ng 1,25 2,25 10 Bez tem. D1-D3 5 0,75 0,75 - 0 3,5 10 Předpokládaný výsledek (vzor) blaZ 1 2 3 4 5 6 genomova DNA Tr.COL 124 ng genomova DNA Tr.COL 12,4 ng genomova DNA Tr.COL 1,24 ng Efektivita Efektivita % Qty(pg/ul) 14000 1400 140 14 1,4 0,14 403000 96200 10400 1,951651 95 log Qty 4,146 3,146 2,146 1,146 0,146 -0,8539 5,605 4,983 4,017 Ct (prumer) 13,5308 17,168 20,6172 24,2799 27,5558 30,6694 8,7016 10,8138 14,1348 StDev +/- 0,0898 0,1136 0,0741 0,0594 0,1389 0,3111 0,2667 0,0629 0,0612 mecA 1 2 3 4 5 6 genomova DNA Tr.COL 124 ng genomova DNA Tr.COL 12,4 ng genomova DNA Tr.COL 1,24 ng genomova DNA COL 109 ng genomova DNA COL 10,9 ng genomova DNA COL 1,09 ng Efektivita reakce Efektivita reakce (%) Qty(pg/ul) 29700 2970 297 29,7 2,97 0,297 103000 14100 927 126000 20700 2610 1,914186 91% log Qty 4,473 3,473 2,473 1,473 0,473 -0,527 5,013 4,149 2,967 5,100 4,316 3,417 Ct (prumer) 13,049 16,444 20,02 23,754 27 30,793 11,108 14,128 18,367 10,772 13,542 16,722 StDev +/- 0,041 0,043 0,043 0,119 0,166 0,138 0,333 0,012 0,328 0,2 0,141 0,046 Závislost Ct na logaritmických hodnotách koncentrací, výpočet efektivity reak Plasmid copy number in bacterial cell 35 -| • plasmid DNA- gene blaZ & genomic DNA - gene mecA -Regression line of genomic DNA (gene mecA) 25 - "^-^-^a -Regression line of plasmid DNA (gene blaZ) Ct 20 - 15 -10 -5 -n ^^^55;- y = -3,5463x + 28,839 ^^S:=5~;4^ R2 = 0,9997 y = -3,4435x + 27,971 R2 = 0,9992 1 i U l l l l l -2 -1 0 1 2 3 4 5 log c [pg] Literatura: Quantitative real-time polymerase chain reaction for determination of plasmid copy number in bacteria.Lee CL. - Ow D.S. - Oh S.K. J Microbiol Methods, 2006, 65: 258-267. LEE C et al. Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number in Escherichia coli. J Biotechnol., 2006,123: 273-280. Characteristics and distribution of plasmids in a clonally diverse set of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains. Kuntova, Lucie & Pantůček, Roman & Rajova, Jana & Růžičková, Vladislava & Petrás, Petr & Maslanova, Ivana & Doškář, Jiří. (2012). Archives of microbiology. 194. 607-614.10.1007/s00203-012-0797-y. Bacteriophages of Staphylococcus aureus efficiently package various bacterial genes and mobile genetic elements including SCCmec with different frequencies. Mašlaňová I, Doškář J, Varga M, Kuntova L, Mužík J, Malúšková D, Růžičková V, Pantůček R. Environ Microbiol Rep. 2013 Feb; 5(l):66-73. doi: 10.1111/j.1758-2229.2012.00378.x. Polyvalentní bakteriofág a jeho endolysin Rostoucí rezistence bakterií k antibiotikům vede k obnovení zájmu o jiné způsoby léčby bakteriálních infekcí. Jednou z využitelných alternativ je fágová terapie, která je známá bezmála sto let. Její princip spočívá v usmrcení bakterií jejich viry označovanými jako bakteriofágy, v přirozeném procesu množení virového potomstva. Ideální terapeutický bakteriofág má široké rozmezí hostitelů, jinými slovy je polyvalentní, nepřenáší žádné geny z hostitele transdukcí a jeho životní cyklus je striktně lytický (Obrázek 1). Při lytickém životním cyklu se fág adsorbuje na povrch hostitele, následuje injekce genomové DNA do buňky, která je v zápětí transkribována a translatována. Postupně dochází k zastavení exprese bakteriálních genů a degradaci bakteriální DNA, namísto toho je replikována fágová genomová DNA a jsou syntetizovány proteiny nezbytné pro průběh infekce a strukturní proteiny fágového kapsidu. Nové virové potomstvo se sestaví uvnitř hostitelské buňky a je následně uvolněno lyží buněčné stěny hostitele. Tu zprostředkovávají fágem kódované enzymy exprimované na konci životního cyklu. Obrázek 1: Životní cyklus lytického fága (ref. https://www.flickr.com/photos/hixtine/6374709127) 0 Attachment ft Phage assembly ■ r/L ■f? Head Tails Tail fibers Release O Assembly 0 Entry of phage DNA and degradation of host DNA © Synthesis of viral genomes and proteins Stafylokokové bakteriofágy s lytickým způsobem života patří do čeledi Myoviridae. Jejich životní cyklus trvá kolem 30 minut a na jeho konci využívají pro uvolnění potomstva z buněk enzymy endolyzin a holin (amidázu). Holiny jsou malé membránové proteiny, které kontrolují správné načasování lyže. V průběhu fágového životního cyklu se akumulují v plazmatické membráně, po dosažení kritické koncentrace se oligomerizují a vytvoří kanálek, přes který jsou transportovány endolyziny. Endolyziny se tak dostanou na místo svého působení neboli k bakteriálnímu peptidoglykanu, který štěpí mezi N-acetylmuramouvou kyselinou a N-acetyl-D-glukozaminem. Endolyziny jsou schopné štěpit buněčnou stěnu i z vnější strany a byly by tak využitelné jako antibakteriální agens. Úloha: Setřih fágového endolyzinu Sestřih RNA byl považován za charakteristický znak exprese eukaryotických genů, avšak dnes je známo i množství prokaryotických genů, jejichž RNA obsahuje introny. Příkladem takového genu je gen pro endolyzin fága K, který infikuje široké spektrum hostitelů druhu Staphylococcus aureus. V dnešním cvičení se seznámíte s izolací RNA u grampozitivních prokaryot a se zásadami práce s RNA. Stejně jako u izolace bakteriální DNA, také bakteriální RNA se purifikuje a izoluje několika možnými způsoby. Mohou se používat speciální komerčně dostupné kity s kolonkami, kde jejich matrix na sebe naváže RNA z roztoku a RNA je postupně purifikována na kolonce. Dále se používá metoda založená na izolaci fenol-chloroformem nebo řada komerčně dostupných produktů, velmi rozšířená je izolace TRIzolem nebo RNazolem. Při práci s RNA je nutné dodržovat několik zásad, protože RNA je velice náchylná na působení RNáz z prostředí. Striktně pracujeme v rukavicích, používáme sterilní špičky s filtrem, pipety určené pro práci s RNA, vodu prostou nukleáz (například ošetřenou diethylpyrokarbonátem = DEPC) a ideálně pracujeme v části laboratoře, která je vymezena pouze pro práci s RNA. Převážná část bakteriální RNA je tvořena dvěma typy ribozomální RNA (16S rRNA a 23S rRNA) a mRNA. Správně izolovaná totální bakteriální RNA tvoří na elektroforetickém gelu dva celistvé proužky (horní 23S a dolní 16S rRNA) (viz obr.). Obr. (a) celková bakteriální 16S a 23S rRNA, (b) purifikované podjednotky bakteriální RNA (b) podjednotky RNA Izolace celkové RNA TRIzolem Níže uvedený postup popisuje izolaci celkové bakteriální RNA pomocí komerčně dostupného TRIzolu. Kit je možné používat pro gram-pozitivní a gram-negativní bakterie. V prvním kroku jsou bakteriální buňky rozrušeny skleněnými kuličkami. Lyži buněk a udržení integrity RNA napomáhá TRIzol. Po přidání chloroformu ve druhém kroku a následné centrifugaci dojde k oddělení bezbarvé vodné fáze s obsahem RNA a růžové organické fáze, která obsahuje buněčné zbytky. RNA je z vodné fáze precipitována izopropanolem a shromážděna na dně zkumavky centrifugací. Po přečištění RNA ethanolem je získaný pelet RNA rozpuštěn v DEPC vodě. Seznam materiálu: • Bakteriální kultura, fág • Komerční kit pro izolaci celkové bakteriální RNA: TRIzol® Max™ Bacterial RNA Isolation Kit; Kat. č.: 16096-040 (Ambion®)1 • Roztoky, chemikálie, média: 20 ml MPB, DEPC voda, chloroform • Plasty: špičky s filtrem, pipety pro práci s RNA • Ostatní vybavení: laminární box pro práci s RNA, stolní centrifuga, mikrozkumavky, Dry Heater Postup2: 1. den 2. den 1. Naočkovat bakteriální kulturu, inkubovat 18h/37 °C ve vhodném kultivačním médiu. 2. Přeočkovat 2 ml kultury do 20 ml čerstvého média a kultivovat při 37°C do OD600 = 0,3 -0,5 (cca 108CFU/ml). 3. Smíchat bakteriální kulturu s 2 ml fágového lyzátu (zásobní titr kolem 108 PFU/ml) a CaCb do výsledné koncentrace 0,002 M. 4. Ihned odebrat 1,5 ml suspenze do sterilní mikrozkumavky (čas T = 0 min), poté pokračovat v odběrech v čase T = 5; 10; 15 a 20 min. 5. Po odběru suspenzi ihned centrifugovat 15 000 rpm/1 min na stolních centrifugách. 6. Získaný pelet resuspendovat v 1 ml TRIzolu a přenést do mikrozkumavky s kuličkami. 7. Homogenizovat na homogenizátoru 2 min. 8. Centrifugovat 10 000 g/3 min/4°C a vzorek přenést do čisté RNase-free zkumavky (bez kuliček!!!!). 9. Přidat 0,2 ml vychlazeného chloroformu a promíchat převracením zkumavky. 10. Inkubovat 2-3 min/laboratorní teplota. 11. Centrifugace 12 000 g/15 min/4 °C. 12. Přenést vodnou fázi obsahující RNA (cca 400 u.1) do čisté mikrozkumavky. Pozn. Je-li vodná fáze narůžovělá, přidat znovu chloroform a opakovat předchozí kroky. 13. Přidat 0,5 ml na ledu vychlazeného izopropanolu a pomalu promíchat převracením zkumavky. 14. Inkubace 10 min/laboratorní teplota. 15. Centrifugace 15 000 g/10 min/4 °C. Opatrně odsát supernatant, RNA se jeví jako poloprůhledný gel na spodu zkumavky. 16. Resuspendovat pelet v 1 ml 75 % etanolu a dobře zvortexovat. 17. Centrifugovat 7 500 g/5 min/4 °C. Opatrně odstranit supernatant. 18. Pelet RNA sušit na vzduchu, nepoužívat sušení ve vakuové odparce. 1 Originální protokol viz stránky distributora kitu: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizolmax_man.pdf 2Před vlastním experimentem je nutné vychladit rotor centrifugy a vychladit chemikálie. 19. Vysušenou RNA rozpustit v 25-50 u.1 DEPC vody. Lze zahřát na 60 °C/10 min, pokud je třeba zvýšit rozpustnost RNA. 20. Na nanodropu zjistit koncentraci a čistotu RNA, uchovávat v lednici při -80°C max 2 měsíce. Ošetření RNA DNázou Pro citlivé analýzy jako PCR, qPCR a sekvenování je nezbytné zbavit vyizolovanou RNA zbytků genomové DNA. Pro tento účel se používají speciální DNázy připravené tak, aby neobsahovaly stopy RNáz. Po proběhnutí reakce je nutné odstranit DNázu, aby nedošlo k degradaci cDNA při reverzní transkripci, a divalentní kationty z pufru, aby nemohly sloužit jako kofaktory pro nukleázy z prostředí. TURBO DNA-free 5 ™ Kit, Catalog nr AM1907 https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms 055740.pdf Postup: 1. Připravit reakční směs o výsledném objemu 50 u.1: Složka Objem RNA max 10 u.g/ 50 u.1 reakční směsi 10x Pufr 10 u.1 DNase 1 u.1 ddhbO doplnit do výsledného objemu 50 u.1 2. Inkubace 60 min/37°C. 3. Zastavit reakci přidáním 0,1 objemu (=5 u.1) Inactivation reagent (ten obsahuje kuličky, dobře ho před přidáním zvortexovat). 4. Inkubace 5 min při laboratorní teplotě, 2-3x promíchat převrácením (flick the tube). 5. Centrifugace 10 000 g/1,5 min, přepipetovat supernatant do sterilní zkumavky. Přepis RNA do cDNA Roche Transcriptor first strand cDNA synthesis Kit, Catalog nr 04379012001 https://shop.roche.com/shop/products/transcriptor-first-strand-cdna-synthesis-kit" HUPracovat na ledu, používat RNasefree plasty, vodu!!!! RNA je pro svou náchylnost k degradaci nevhodná pro dlouhodobé skladování a další aplikace. Z toho důvodu se přepisuje do komplementární DNA pomocí reverzní transkriptázy. Rekombinantní enzym v tomto kitu má také aktivitu RNázy H, která degraduje RNA z RNA:DNA hybridu. Jako primery se u reverzní transkripce využívají náhodné hexanukleotidy nebo oligodT. Pro zvýšení stability RNA za vyšších teplot se do reakční směsi přidává také Inhibitor RNáz. Pro ukončení reakce se směs zahřeje na vysokou teplotu, čímž dojde k degradaci reverzní transkriptázy. Postup: 1. Připravit mastermix (bez RNA) podle následující tabulky Složka Zásobní koncentrace Výsledná koncentrace Objem v 1 vzorku (20 u.1) Objem v .... vzorcích Random hexamers 600 u.M 60 pM 2pl Pufr 5x lx 4 pl RNase Inhibitor 40 U/u.1 20 U 0,5 ul dNTP 10 mM každý 1 m M každý 2ul RT 20 U/u.1 10 uJ 0,5 ul ddH20 - - YY ul RNA Do 1 ug XX ul 2. Rozpipetovat směs do mikrozkumavek, přidat RNA (pokud byla skladována v mrazáku, nahřát předem 10 min při 65°C a schladit na ledu). 3. Inkubovat 10 min/25°C (dochází k nasedání primeru). 4. Inkubovat 30 min/55°C (dochází k syntéze cDNA, především produktů do 4 kbp). 5. Inaktivovat reverzní transkriptázu 85°C/5 min, poté schladit na ledu. 6. Uchovávat -15 až -25°C. PCR pro detekci sestřihu endolvzinu Navržená PCR využívá jednoho forward primeru F nasedající na 5' konec genu a dvou reverse primeru. První reverse primer Rl se váže v oblasti intronu, druhý reverse primer R2 se váže do exonu za intronem (obr). Při PCR reakcích z genomové DNA vzniká pro primerový pár F a Rl produkt dlouhý 1062 bp a pro primerový pár F a R2 produkt o délce 1600 bp. Při PCR se sestřiženou RNA (cDNA), pak primery F a R2 dají vzniknout produktu o délce 732 bp. Produkt z primeru F a Rl nevzniká. Nesestřižená RNA F amplikony intron ŘT R2 1062 bp 1600 bp Sestřižená RNA R2 amplikony 723 bp Postup: 1. Namíchat PCR pro každý z reverse primeru podle následujícího rozpisu Tab Složka Zásobní koncentrace Výsledná koncentrace Objem v 1 vzorku (25 u.1) Objem v......vzorcích FastStart 2x lx 12,5 ul Primer F 10 uM 0,4 uM lul Primer R 10 uM 0,4 uM lul ddH20 - - 8,5 ul cDNA 2ul 2. Vložit vzorky do termocykleru a nastavit program podle Tab Cyklus Teplota Čas Počet cyklů Počáteční denaturace 94 °C 5 min 1 Denaturace 94 °C 45 s 35 Nasedání primerů 50 °C 45 s Extenze 72 °C 90s Závěrečná extenze 72 °C 7 min 1 Chlazení 4°C nekonečno 3. Provést gelovou elektroforézu, jako marker využít žebříček 2log. Literatura: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizolmax man.pdf Role of SH3b binding domain in a natural deletion mutant of Kayvirus endolysin LysFl with a broad range of lytic activity. Benešík, M., Nováček, J., Janda, L et al. Virus Genes (2018) 54:130. https://doi.org/10.1007/sll262-017-1507-2 PRACOVNÍ LIST I Mutace Vypracoval: Jméno, Příjmení, UČO Semestr (skupina)...... 1. Vypočítejte frekvenci spontánních mutant ve vašem vzorku. 2. Navrhněte tři způsoby mutageneze používané v genovém inženýrství. 3. Jaká je pravděpodobnost vzniku mutace u prokaryot? 4. K čemu slouží fluktuační test? Nakreslete schéma fluktuačního testu a stručně popište. 5. Vysvětlete proč je pro nárůst mutantních kolonií na gradientu streptomycínu potřeba více času než pro nárůst kolonií bez mutace? 6. Vysvětlete rozdíl mezi spontánní a indukovanou mutací. Jaký typ mutace jste sledovali ve svém experimentu vy? PRACOVNÍ LIST II Transdukce a stanovení počtu kopií transdukovaných plazmidů v buňce pomocí QPCR Vypracoval: Jméno, Příjmení, UČO........................................................................................................................... Semestr (skupina)................................................................................................................................. 1. Vypočítejte frekvenci vámi provedené transdukce plazmidů Frekvence transdukce pro plazmid pT181 (tetK, rezistence k tetracyklínu): Frekvence transdukce pro plazmid pHOUMR-like (rezistence ke kadmiu): Je frekvence transdukce stejná pro oba typy plazmidů? Vysvětlete. 2. Vytvořte graf závislosti log koncentrace na Cp standardu a neznámých vzorků u vámi provedené qPCR. - použijte data uvedená v pdf souborech, které exportujete po dokončení reakce - proložte datové body regresní přímkou a vypočítejte rovnici přímky a R2 pro oba běhy (kvantifikace genu blaZ nebo tetK a genu SAU) do jednoho grafu - vypočítejte a uveďte efektivitu obou běhů v % - zdůvodněte proč je hodnota E menší případně větší než 100% -srovnejte svoje výpočty s výsledky uvedenými v pdf souborech 3. Vypočítejte hodnoty PCN (počet plazmidů na buňku) pro transduktanty. 4. Proč se do transdukční směsi přidává citrát sodný? 5. Jak byste ověřili, že na selekčních plotnách vyrostly transduktanty a nejedná se o kontaminaci donorem nebo jiným druhem? 6. Jak byste odlišili transdukující částice od životaschopných fágů? 7. Jakým způsobem se bakterie brání přijímání cizorodé DNA? A jakými mechanizmy podporují příjem nové genetické informace? PRACOVNÍ LIST III Konjugace Vypracoval/a: Jméno, Příjmení, UČO....... Semestr (skupina).............. 1. Vyjádřete frekvenci získaných rekombinantů na počet buněk Hfr. 2. Jaké jsou hlavní rozdíly v konjugaci mezi grampozitivními a gramnegativními bakteriemi? 3. Dochází ke konjugaci i u jiných prokaryotických či eukaryotických organizmů (Archea, kvasinky, plísně, protozoa)? 4. Ve své oblíbené bakterii jste identifikovali plazmid. Jak byste zjistili, zda je konjugativní? PRACOVNÍ LIST IV GTA Vypracoval/a: Jméno, Příjmení, UČO Semestr (skupina)...... 1. Napište 3 vlastnosti, které jsou pro GTA a bakteriofágy společné/rozdílné: 2. Vyhledejte v literatuře, proč se Rhodobacter capsulatus inkubuje za anaerobních podmínek a v osvětleném termostatu. 3. Lyže buněk navozená uvolňováním GTA je v úloze kontrolována měřením absorbance supernatantu spektrometrem pro vlnové délky 750-950 nm. Přiložte obrázek měření vašeho vzorku a srovnejte s obrázkem níže. Vysvětlete, co pozorujeme. Obrázek: Absorpční spektrum intracelulárních pigmentů R. capsulatus 850 Wavelength (nm) 4. Jaký je mechanizmus přenosu Rif rezistence a jejího stabilního udržení v recipientní populaci bakterií? PRACOVNÍ LIST V Pulznígelová elektroforéza (PFGE) Vypracoval: Jméno, Příjmení, UČO........................... Semestr (skupina).................................. 5. In silico PFGE Pomocí nástroje http://insilico.ehu.es/digest/ proveďte in silico PFGE genomu Staphylococcus aureus subsp. aureus N315. Použijte restriktázu Smol. a) Kolik fragmentů vznikne takovýmto štěpením. b) Jaká je sekvence rozpoznávacího místa pro restriktázu Smol c) Jakou další restriktázu (případně restriktázy) by bylo možné použít, abychom získali 20 až 30 fragmentů DNA. d) Jaké enzymy byste využili pro PFGE u jiných druhů bakterií? Uveďte tři příklady. 6. Změna restrikčního spektra: Na následujícím schématu in silico PFGE genomu S. aureus vyznačte a slovně popište, jak by se na restrikčním spektru projevila: Length of sequence (sorted) 535693 443537 3 2 £470 289765 269896 216659 127930 118599 109304 77889 58860 56450 41324 32506 23881 22057 19873 16295 9443 3104 3104 3100 3100 3010 2967 PFGE 727.5 lit) 4B!"] íľl) ass a *b 2Ď1 QKlj 1W Okb ■.- ■ ■ l-l ■ 4B.5 kb PFGE 1.2% Agatosů Lambda Ladder PFGE spektrum a. PFGE spektrum b. a) Integrace bakteriofága o přibližné velikosti genomu 44 kb, který nenese reštrikční místo pro Sma\. Uvažujte začlenění do fragmentu o velikosti 77 889 bp. b) Mutace vedoucí ke vzniku nového Smol restrikčního místa, které rozdělí fragment o velikosti 216 659 bp cca na poloviny. 7. Na obrázku elektroforetického gelu genomové DNA vybraných stafylokokových kmenů štěpených restrtiktázou Smol vyznačte a slovně popište změnu v restrikčním spektru, která nastala. Srovnejte s Vašimi výsledky. a. Integrací fága 53 do genomu kmene S47 b. Integrací fága 11 do genomu kmene ISP8 c. Integrací fága 47 do genomu kmene ISP8 d. Integrací fága 77 do genomu kmene ISP8 PS47 II I |) PS47(53+) I I I ,SP8 IM I f I ISP8"" ISP8 (47+) I I ISP8 (77+) PRACOVNÍ LIST VI Plazmidy Vypracoval: Jméno, Příjmení, UČO Semestr (skupina)...... 1. Navržení primem Navrhněte primery pro plazmidový gen tetK (kóduje protein pro efluxní pumpu - navozuje rezistenci k tetracyklinu). Přístupové číslo proteinu TetK je YP_006958133 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/YP 006958133.1). a. Napište nukleotidovou sekvenci navržených primerů ve směru 5'- 3' a jejich Tm teplotu. primertetK_F:........................................................................Tm:.................................................... primertetK_R:........................................................................Tm:...................................................... b. Navrhněte program PCR reakce a složení PCR směsi, budete-li používat: OneTaq® 2X Master Mix with Standard Buffer (https://international.neb.com/products/m0482-onetaq-2x-master-mix-with-standard-buffer#Product%20lnformation) Řiďte se doporučením výrobce. PCR směs: Reagencie Zásobní koncentrace Výsledná koncentrace Objem (|jl) pro jednu reakci OneTaq®2X Master Mix with Standard Buffer 2x 1x primer-F 10 u M 0.2 uM primer-R 10 u M 0.2 uM Templátová DNA < 1000 ng Voda x x Celkem 25,0 pi Program PCR: teplota doba trvání v s počet opakování Počáteční denaturace Denaturace Připojení primem Prodlužování primem Závěrečné prodlužování primem 2. Seřaďte jednotlivé typy konformace plazmidů podle jejich elektroforetické mobility od nejnižší po nejvyšší a přiložte elektroforetogram Vašich vzorků: • Štěpená, otevřená cirkulární forma (nicked) • Uvolněná cirkulární forma (relax circular) • Lineární forma (linear) • Superspiralizovaná forma (supercoiled) 3. Stručně popište princip izolace plazmidové DNA pomocí komerčních kitů pro izolaci plazmidové DNA (pro PCR, klonování, sekvenování, in vitro transkripce). V kterém kroku dojde k separaci plazmidové DNA od chromozomální DNA ? PRACOVNÍ LIST VII Endolysin Vypracoval: Jméno, Příjmení, UČO Semestr (skupina)...... 1. Popište, jak na elektroforetogramu vypadá nedegradovaná celková RNA. 2. Na základě provedeného exerimentu (přiložte obrázek elektroforetického gelu) odpovězte na následující otázky: a) Dochází k sestřihu endolysinu? b) Detekovali jste v buňkách i nesestřiženou RNA? Pokud ano, pokuste se vysvětlit proč? c) Vyznačte na obrázku, ve které dráze elektroforetického gelu je správně izolovaná celková RNA. Vysvětlete proč. 3. Jaké další geny jsou u prokaryot sestřihovány? 4. Jaké typy intronů se u prokaryot vyskytují? 5. Jak se v roztoku zbavíte dvoumocných kationtů? 6. Jaká je u fága funkce genu pro endolyzin? 7. Jaký je význam intronů? 8. Který enzym se používá k přepisu RNA do cDNA v laboratorních podmínkách a jaké primery se používají pro přepis prokaryotické mRNA?