Stanovení počtu plazmidů na buňku
(PCN) pomocí QPCR
RealTime PCR
1. Kvantitativní vztah mezi množstvím PCR produktu a intenzitou fluorescence
- účinnost PCR musí být u všech vzorků stejná
- amplifikační práh (Ct) musí ležet v exponenciální fázi (lineární část křivky)
2. Fluorescence R
- zajištěna vazbou fluorescenčního interkalačního bariva na DNA (SyberGreen), použitím
hydrolyzační sondy apod.
-sledujeme změnu fluorescence v čase vůči pozadí
3. Treshold cycle Ct
-učený na základě hodnoty fluorescence pozadí, kvantitativní výstup pro každý vzorek
- udává počátečná množství kopií templátu, definovaný v exponenciální fázi PCR
- čím menší Ct, tím větší počet kopií templátu na začátku reakce
- rozdíl 1 Ct – dvojnásobné množství templátu 21= 2
- desetinásobný rozdíl v množství cyklů odpovídá
2n=10 n=log10/log2=3,32
4. Účinnost RealTime PCR - E
- účinnost PCR je 100% jen výjimečně
- běžně rozmezí E = 1,60 - 2,10, R2 > 0,989
y = -3,5463x + 28,839
R2
= 0,9997
y = -3,4435x + 27,971
R2
= 0,9992
y = -2,9645x + 23,566
R2
= 0,9933
0
5
10
15
20
25
30
35
-2 -1 0 1 2 3 4 5
plazmidová DNA - gen tetK
plazmidová DNA- gen blaZ
celogenomová DNA - gen mecA
Lineární (celogenomová DNA - gen mecA)
Lineární (plazmidová DNA- gen blaZ)
Lineární (plazmidová DNA - gen tetK)
size of chromozomal DNA (bp) * amount of plasmid DNA (pg)
PCN per genom =
size of plasmid DNA (bp) * amount of genomic DNA (pg)
Quantitative real-time polymerase chain reaction for
determination of plasmid copy number in bacteria
(Chai Lian Lee et al,2006)
Určení počtu kopií plazmidů na buňku (PCN)
y = -3,4435x + 27,971
R² = 0,9992
y = -3,5463x + 28,839
R² = 0,9997
0
5
10
15
20
25
30
35
-2 -1 0 1 2 3 4 5
Ct
log c [pg]
Plasmid copy number in bacterial cell
plasmid DNA- gene blaZ
genomic DNA - gene mecA
Regression line of plasmid DNA (gene blaZ)
Regression line of genomic DNA (gene mecA)
blaZ
pUSA300HOUM
R (27,041 kb)
pT181
(4,4 kb)
tetK
2,809.106 * 1,04.103
PCN (pT181) =
2,7.104 * 927
= 45 kopií
2,809.106 * 6,69.101
PCN (pT181) =
4,4.103 * 927
= 1,2 kopií