Masivně paralelní sekvenování
Boris Tichý
Sdílená laboratoř Genomika
Brno, 21.10.2019
2
Informace je uložená v DNA
Informace uložená jako sekvence bazí A, C, G, T
V každé lidské buňce je ~ 3 miliardy bazí = ~ 3 metry = ~ 6.6 pikogramů
Sekvence DNA je v každé bunce stejná
3
Sekvenování DNA
Vytvoření různě dlouhých fragmentů DNA
Dideoxy-NTPs → ukončení polymerace
Gel → kapilární elektroforéza
Značené primery nebo ddNTPs
https://www.youtube.com/watch?v=FvHRio1yyhQ
https://www.youtube.com/watch?v=e2G5zx-OJIw
4
Masivně paralelní sekvenování
PCR amplifikace jednotlivých DNA fragmentů a sekvenování
nebo
Sekvenování jednotlivých DNA fragmentů
= Single molecule sequencing
Sekvence je čtena při syntéze nového řetězce
Technologie a přístroje přizpůsobeny paralelizaci
Stovky milionů jednotlivých PCR reakcí a sekvenací najednou
(běžně prodávané kapilární sekvenátory jsou max. 96-kapilární)
Většinou kratší sekvence – desítky bazí
(kapilární – běžně až 1000 bazí)
5
Sekvenování DNA
Masivně paralelní sekvenování
Sequencing by synthesis
Polymeráza
Sestavování nového řetězce z jednotlivých nukleotidů
Sequencing by ligation
Ligáza
Sestavování nového řetězce z oligonukleotidů
Non-enzymatic sequencing
Nanopory, elektronová mikroskopie
Přímé čtení sekvence
7
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Illumina
Bridge amplifikace
8
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Illumina
Sekvenování s
reverzibilními terminátory
https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8
9
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Illumina
Patterned flowcell + exclusive amplification
https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8
https://www.youtube.com/watch?v=DJQn-qA6tTw
10
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Illumina
Sekvenování s reverzibilními terminátory
11
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Illumina
HiSeq X Ten – kapacita 18.000 genomů ročně,
cena za genom $1.000, cena $10M
HiSeq 4000
Kapacita 12
genomů/běh
(24/týden),
1,5TB/běh
NextSeq 500
Kapacita 1
genom/běh
(3/týden),
120GB/běh
MiSeq
Kapacita 0,15
genomu/běh, 15GB/
běh
NovaSeq
Kapacita 48 genomů/běh, 6TB/běh
MiniSeq
Kapacita 0,07
genomu/běh,
7,5GB/běh
iSeq
Kapacita 0,01
genomu/běh,
1,2GB/běh
12
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Ion
Emulzní PCR
13
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Roche/454
Pyrosekvenování
https://www.youtube.com/watch?v=rsJoG-AulNE
Masivně paralelní sekvenování Technologie Ion Torrent
https://www.youtube.com/watch?v=ZL7DXFPz8rU&t
Masivně paralelní sekvenování Technologie Ion Torrent
Ion Torrent PGM
Kapacita 2GB/běh
Ion S5
Kapacita 10+GB/běh
Ion Proton
Kapacita 10+GB/běh
16
Masivně paralelní sekvenování
Qiagen GeneReader
Uzavřená technologie
emPCR + SBS
17
Masivně paralelní sekvenování
Class IIs restriction
endonucleases
400 – 500 bp
Technologie cPAL
18
Masivně paralelní sekvenování
19
Masivně paralelní sekvenování
20
Masivně paralelní sekvenování
Sekvenování (hybridizací a) ligací
21
Masivně paralelní sekvenování
Technologie cPAL
Kompletní systém pro sekvenování lidských genomů a exomů
Výrobce BGI (Čína)
Kapacita 12.000 genomů/rok, cena $ 12M
22
Masivně paralelní sekvenování
Technologie cPAS
BGISEQ-500 BGISEQ-50
DNBSEQ-T7 DNBSEQ-G50DNBSEQ-G400
20G/6Tb 300M/60Gb3,5G/1,4Tb
2,6G/520Gb ?M/?Gb
23
Masivně paralelní sekvenování
Technologie SMRT
(Single Molecule Real Time)
With an active polymerase immobilized at the bottom of
each ZMW, nucleotides diffuse into the ZMW chamber.
In order to detect incorporation events and identify the
base, each of the four nucleotides A, C, G and T are
labeled with a different fluorescent color. Since only the
bottom 30nm of the ZMW is illuminated, only those
nucleotides near the bottom fluoresce.
http://www.pacb.com/smrt-science
https://www.youtube.com/watch?v=NHCJ8PtYCFc
https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI
24
Masivně paralelní sekvenování
Oxford Nanopore
https://www.nanoporetech.com
https://www.youtube.com/watch?v=hs0FdiTHMbc
https://www.youtube.com/watch?v=GUb1TZvMWsw
'Strand sequencing' is a technique that passes
intact DNA polymers through a protein
nanopore, sequencing in real-time as the DNA
translocates the pore.
SmidgION
MinION
GridION
PromethION
25
Masivně paralelní sekvenování
ReadCoorFluorescent In Situ Sequencing
26
Kontrola kvality vzorku
Metody
Spektrofotometrie
Fluorimetrie
Elektroforéza
PCR/qPCR
Problematické vzorky
FFPE – fragmentace, modifikace
Rostliny – kontaminace
Tkáně – fragmentace
...
27
Kontrola kvality vzorku
NanoDrop
Trinean DropSense
Substrakce kontaminant
…
Spektrofotometrie
28
Kontrola kvality vzorku
Qubit
Fluorimetrie
Fluorescenční barviva
Aktivace vazbou s DNA/RNA
PicoGreen
RiboGreen
OliGreen
Kvantifikace neovlivněná kontaminanty
Selektivní kvantifikace dsDNA, ssDNA, RNA
29
Kontrola kvality vzorku
Elektroforéza
Integrita (fragmentace)
Kontaminace
Koncentrace
Agarosový gel
Fragment Analyzer
BioAnalyzer
TapeStation
...
30
Kontrola kvality vzorku
PCR/qPCR
Kontrola integrity
PCR produkty různých délek
Kvantifikace
Detekce PCR inhibitorů
Děkuji za pozornost
Středoevropský technologický institut
c/o Masarykova univerzita
Žerotínovo nám. 9
601 77 Brno, Česká republika
www.ceitec.cz | info@ceitec.cz