MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/15.0204 Metodologie molekulární fylogeneze taxonomie hmyzu BÍ7770 Andrea Tóthová INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Metody Molekulární znaky mají oproti klasickým řadu výhod: Je jich libovolné množství Jsou vzájemně distinktní, kvalitativní Umožňují srovnávat i nepříbuzné organizmy Jsou selekčně neutrální Kde se molekulární biologie využívá? Recentně aplikované technologie - genetické inženýrství, DNA finger-printing v sociální a forenzní sféře, pre a postnatální diagnostika dědičných nemocí, genová terapie, „ drug design"... Detekce infekčních nemocí, monitoring populací, záchrana ohrožených druhů, příbuzenské vztahy... Základné metody • Štěpení NK • Polymerase chain reaction • Proby, hybridizace • Vektory, molekulární klonování • Microarrays • DNA sequencing • Elektroforetická separace NK • Detekce genů: *DNA: Southern blotting; inSitu hybridization; FISH Technique *RNA: Northern blotting *Protein: Western blotting, immunohistochemistry K purifikaci (extrakci) nukleových kyselin může být jako vstupní materiál použit: • krev • tkáň • bakterie • houby • živočišné buňky • rostlině buňky • exkrementy, vývržky • agarózové gely Výběr použité techniky závisí pouze na nás... • typ vstupného materiálu • očekávaný výtěžek • věk vzorků • čas • finance • požadovaná kvalita Všeobecný postup extrakce: 1. Digesce tkáně / lyže buněk 2. „chelátování" (zbavujem se divaletních katiónu, zastavujem fungovaní mnoha enzymů) a proteinázová fáze (štěpíme a inaktivujeme proteiny a enzymy) 3. Separace NK a proteinů 4. Pročištění Digesce tkání/ lyže buněk • narušit buňky nebo tkáně • vyhnout se metodám, které narušují DNA • zvolená metoda závisí na typu buněk Příklady metod: • enzyme-based lyzozymy • ultrazvuk tekutý dusík SDS-based narušení membrány QIAGEN DNeasy B&T kit 1. Lyže tkání - ATL buffer 2. Použití Proteinase K - rozkládá proteiny a inhibuje nukleázy 3. Lyze: Buffer AL (guanidium-HCI) - hypertonický solný roztok 4. Spin column - DNAse naváže na silica-membránu 5. Promytí Washing bufferem 6. Eluce 1 (příp. 2), s Bufferem AE (Tris-EDTA) E.Z.N.A. (Omega Bio-tek) 1. Lyze: Buffer TL - hypertonický solný roztok 2. Použití Proteinase K - rozkládá proteiny a inhibuje nukleázy 3. Vysrážení DNA s EtOH 4. Spin column - DNA se naváže na silica-membránu 5. Aplikace HBC bufferu (guainidinium chloride) 6. Promytí (wash buffer) 2x 7. Eluce 1 (příp. 2), s teplým bufferem EB (Tris- EDTA) při 70°C Jak to bylo s PCR? • 1983- Kary Mullis, vědec pracující pro Cetus Corporation řídil podél US Route 101 v severní California když ho napadla myšlenka polymerázové řetězové reakce • 1985 - metoda PCR byla představena vědecké komunitě na kongresu • Cetus odměnil Karyho Mullise $10,000 bonusem za jeho nápad • později, počas korporátní reorganizace Cetus prodává patent na PCR farmaceutické firmě Hoffmann-LaRoche za $300 millionů Život není fair! PCR: Amplifikace DNA • Často je k dispozici jen malé množství DNA - kapka krve -vzácný typ buněk • V současnosti existují dvě metody pro amplifikaci DNA nebo tvorbu kopií - klonování—trvá dlouho, než dostatek klonů dosáhne požadovaného stupně kvality - PCR—funguje dokonce i na jediné buňce hned Co potřebuje PCR? • Templát (DNA, kterou testujeme) • Specifické primery pro studovanou oblast, forward a reverz • Polymeráza • Nukleotidy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) • Magnesium chloride (enzyme cofactor) • Buffer • Enhancer • Vysoce kvalitní DNA-free voda, minerální olej anebo co nám kdo předmíchal • DNA vzorku • HiFi polymeráza • Buffer • Primery • Voda Všeobecné PCR podmínky • Magnesium chloride: 0.5-2.5mM • Buffer: pH 8.3-8.8 • dNTPs: 20-200|iM • Primery: 0.1-0.5|iM • DNA Polymeráza: 1-2.5 units • Templátová DNA: < 1 \xg Jak tedy probíhá PCR? • Horko (94°C) k denaturaci DNA dvouvláken • Zchlazení (54°C) k přisednutí primem k templátu • Teplo (72°C) k aktivaci Taq Polymerázy, která prodlužuje primery a replikuje DNA • Opakování cyklu Denaturace Denaturace je první krok, kde se DNA rozpojí vlivem tepla Vodíkové můstky se přeruší a obě vlákna se oddělí 5' 3' -'N/N/ 3' 5' 5' 3' 3' 5' Annealing Annealing je proces vytváření vodíkových vazeb, kdy nasednou specifické primery na komplementární místo templátu Probíhá při zchlazení na 55°C nebo jinou annealingovou teplotu. Čas potřebný k tvorbě nového vlákna je ca. 45 sekund (pro 1 kb) 5 N/N/^ 3' 5' Elongace Taq polymeráza se váže k templátu a začne připojovat volné nukleotidy komplementární k původnímu řetězci Probíhá to u 72°C jako optimální teplotě pro TAQ sw^-........—'W3' ' ' 3' 5' 3 '......L-*w5' 1 PCR Review • Denaturace: 94°- 95°C • Primer Annealing: 40°- 65°C • Elongace DNA: 72° • Počet cyklů: 25-40 • Žádný cílový produkt se netvoří do 3. kroku • Po 30 cyklech je v roztoku 1,073,741,764 cílových kopií (~1 x109). PCR Primery Primer je úsek NK, který slouží jako startovací místo replikace Je potřeba mít jak forwardní, tak reverzní primer, aby byla cílová sekvence tvořena simultánně v obou směrech Design PCR primem • Sekvence primem by měly být unikátní • Sekvence primem by měly být ~20 bazí dlouhé • Obsah G/C by měl být 45-55%. • Annealingová teplota by měla být podobná • Na 3'-konci by měly být G nebo C. • Nesmí mít self-komplementární oblasti nebo vytvářet hairpiny • Nesmí mít repetitivní oblasti Problémy s primery • Primery by měly ohraničovat cílovou část DNA sekvenci • Primery, které jsou komplementární k více místům, budou tvořit víc produktů • Primer může tvořit dimér se sebou nebo s druhým primerem 5'- ACCGGTAGCC ACG AATTCGT-3' 3 - TGCTTA AGC ACCG ATGGCC A-5 Primery, co tvoří hairpiny • Primery můžou mít komplementární oblasti v rámci sebe , tudíž budou tvořit tzv. hairpin 5 '-GTTG ACTTG ATA 3-GAACTCT • 3' konec primem se bude párovat uvnitř primeru a nebude reagovat s templátem PCR Taq DNA Polymeráza • Taq je odvozen z názvu Thermus aauaticus, bakterie nalezené v 176°F (80°C) horkých pramenech v Yellowstone National Park Forest. • Taq DNA Polymerase (Taq Pol) je stabilní při vysokých teplotách a k činnosti potřebuje správnou koncentraci Mg • Optimum pro její fungování je 72°C Nevýhody Taq Pol • Taq Pol nemá 3' to 5' exonucleázovou aktivitu přítomnou u jiných polymeráz, tudíž nedochází k „proofreadingu" • Taq špatně zařadí 1 bázi v 104 • Situaci muze resít pridaní dalsi polymerázy s exonukl.aktivitou (sama ovšem způsobuje degradaci primerů) Jak předejít problémům? • Pfu DNA Polymeráza z Pvrococcus furiosus má 3' to 5' exonucleázovou aktivitu • Chybovost je pouze 3.5% po 20 cyklech • Po přidání většího množství primeru lze předejít dimerům • Pro neznámé geny lze použít primery příbuzných druhů Limitace PCR • Jsou potřebné informace o cílové sekvenci design primerů pro neznámé známé hraničně oblasti Chybovost při DNA replikaci Taq Pol - 1 nt /4000-5000bp • Krátká délka a omezené množství produktu do 5kb je lehko amplifikovatelný produkt. do 40kb je amplifikace s modifikacema možná nelze amplifikovat geny >100kb Výhody PCR • Rychlost • Snadné použití • Citlivost • Robustnost Agarózová gelová elektroforeze Elektroforeze je způsob separování molekul na základě rychlosti jejich pohybu v gelu v elektrickém poli 5 END O 0 - P—O—CHř L/^g) -0- 5r O" 4 DNA má negativní náboj 0 díky cukrofosfátové kostře O H 0=p—O—CH, 0 H 1 0= o- DNA putuje od černé negativní elektrody (katody) k pozitivně nabité elektrodě (červená) - anodě Agaróza D-galactose 3,6-anhydro L-galactose Polymerizací vytvoří pevný gel, který je pórovitý a umožňuje pohyb DNA Krátké DNA fragmenty prochází gelem rychleji než dlouhé Agarozovy gel smichanim a.p se pripravi rasku a pufru Buffer I Erlenkl k pnpri Ethidium Interkaluje se do NK a emituje světlo po ozáření UV světlem Mutagen! Nanášení vzorků PCR produkty se smíchají s nanášecím pufrem -obarví je a zvýší denzitu - zabrání vyplavení vzorku z jamky 6X Loading Buffer: • Bromfenolová modrá • Glycerol a pod UV světlem M 1 2 3 kb 23 H 9.4-^ 6.6- 4A-\ 2.3 2.01 0.6-J Hledaní v odpadu není nic moc! Zdroj: www.flickr.com/photos/50262392@N00/45684291