Metodologie molekulární fylogeneze a taxonomie hmyzu Bi7770 MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/15.0204 Andrea Tóthová Co se tady bude dít.. • proč DNA a jak to s ní vlastně bylo... • Přehled základních metod • Sekvencování NK • Sbírání dat a co pak s nima, tvorba knihoven, GenBank, AToL • Zásady bezpečné práce v laboratoři Co tady budem používat... Sequencher – placený SW MEGA Paup - dtto MrModeltest MrBayes RAxML Garli CIPRES FigTree TreeView TNT iTOL http://evolution.genetics.washington. edu/phylip/software.html Co je molekulární biologie? Co je molekulární fylogenetika? Jsou kladistika a fylogenetika sestry? Od biologie k molekulární biologii • Molekulární biologie - studium struktury a funkce genu na molekulární úrovni pro pochopení základu dědičnosti, genetické variace a exprese znaků genů • Překrývá se s dalšími oblastmi, jako např. genetika a biochemie • Fylogeneze (vznik a vývoj jednotlivých vývoj. linií) – kladogeneze (pořadí a způsob větvení VL) a anageneze (hromadění fenotypových změn ve VL) • Last Universal Common Ancestor • Větve, uzly, stromy… • Homoplázie (znak nepřítomen u společ.předka) a homologie (znak zděden od nejbližšího předka) • Plesiomorfie a apomorfie • Co na to Haeckel a von Baer? – pravidlo rekapitulace Molekulární znaky mají oproti klasickým řadu výhod: • Je jich libovolné množství • Jsou vzájemně distinktní, kvalitativní, na sobě nezávislé • Umožňují srovnávat i nepříbuzné organizmy • Jsou selekčně neutrální, není nutno je vážit Molekulární fylogenetika využívá molekulárně-biologické znaky pro účely fylogeneze a systematické biologie Jak to vše začalo… • bakteriofág…chromatografie… ...dvouzávitnice... • Jak to s DNA vypadá • Dvouzávitnice – stavba - primární a sekundární struktura Začátky molekulární biologie • Moderní molekulární biologie začíná v 30. letech konvergencí dalších biologických disciplín, jako biochemie, mikrobiologie, genetika a virologie s nadějí pro pochopení života a jeho nejzákladnějších procesů – mnoho fyziků a chemiků obrátilo svou pozornost na nové možnosti využití známých postupů k objevování „neviditelného světa“ DNA - dědičnost a struktura • To, co dnes víme o DNA, nebylo objeveno přes noc • Mnoho různých vědců přispělo k výzkumu a jejich zásluhou dnes nejen známe model DNA, ale taky můžeme předpovědět další zatím neznámé „věci“ Jedni z prvních… • Genetický materiál je DNA – Alfred Hershey a Martha Chase, 1952 • Do té doby byly proteiny považovány za původce přenosu gen. informace • Hershey a Chase pracovali s viry, které napádaly bakterie – bakteriofágy • Série experimentů prokázala úvodní konstatování Martha Chase a Alfred Hershey Wilkins a Franklinová • Maurice H.F. Wilkins a Rosalind Franklinová, 50.léta • Wilkins a Franklinová studovali strukturu DNA krystalů pomocí X-paprsků • Zjistili pravidelně se opakující oblasti v krystalu • Vzorek DNA obsahuje struktury o rozměrech 2 nm, 0.34 nm, a 3.4 nm. Tmavé struktury na vrchole a spodku se opakovaly indikujíc závitnici Rosalind Franklinová Konečně.. • James Watson a Francis H.C. Crick, 1953 • Watson and Crick použili Chargaffovy základní data a Franklinovy výsledky z röntgenové analýzy a sestrojili model DNA • Model ukázal, že DNA je double helix s cukro-fosfátovou kostrou, na kterou se zevnitř připojují nukleotidy • Chargaffovo pravidlo ukázalo komplementaritu párování bazí A = T a G = C, tedy purinů s pyrimidiny, co dalo dvouzávitnici správnou šíři • Párování bazí může proběhnout v libovolném pořadí, což umožňuje nekonečnou diversitu sekvence První dokument o DNA publikován v Nature 25. dubna 1953 Chargaffovy pravidla • Base-pairing pravidlo je A-T and G-C • Thymine je nahrazen Uracilem v RNA • Báze jsou navzájem spojeny vodíkovými můstky • Bylo objeveno díky relativnímu obsahu jednotlivých bazí (obsah A-T je podobný a C-G totéž) • Obsah A/T/C/G je druhově specifický Erwin Chargaff • Double Helix – stočený žebřík • Tvořen monomery AKA nukleotidy • Nukleotidy sestávají z: – Deoxyribózového cukru – Fosfátové skupiny – Dusíkaté baze • dva typy: – Puriny – Pyrimidiny Puriny: Adenine a Guanine Pyrimidiny: Thymine a Cytosine DNA je nekonečná struktura • „Šprušle“ žebříku můžou jít za sebou v libovolném pořadí (zákon komplementarity musí platit) • 4 báze mají v nekonečné množství kombinací Základ všeho.. • Kostra tvořena střídáním cukru a fosfátu K cukru se VŽDY připojuje dusíkatá báze • DNA byla nalezena v jádru eukaryot a také v cytoplasmě prokaryot • DNA je „sbalena“ a obtočena kolem speciálních proteinů zvaných HISTONY • DNA obalující protein tvoří komplex zv. CHROMATIN • Když chromatin zkondensuje (ztloustne), tvoří CHROMOSOMY supercívka chromozom cívka nukleozom histony DNA dvouzávitnice Centrální dogma molekulární biologie DNA tvoří kopie sebe samé • Replikace – proč je potřeba? • Jednoduché: v každém organizmu se buňky dělí, aby byl zabezpečen růst a reprodukce organizmu, tudíž nové buňky potřebují DNA s instrukcemi, jak být buňkou • DNA se replikuje těsně před dělením buňky. Replikace… • DNA se musí rozplést a zrušit vodíkové můstky • Obě rozpletené strany slouží jako templát k replikaci • Z původní dvouzávitnice jsou vytvořené pomocí DNA polymerázy dvě nové vlákna • Počas replikace enzym helikáza „odzipuje“ DNA • Další enzym – DNA polymeráza se posunuje podél vlákna a připojuje komplementární volné nukleotidy Replikační vidlice růstDNA polymeraza Nové vlákno Původní vlákno Dusíkaté báze DNA Polymeráza DNA – RNA – DNA nekonečný cyklus • RNA má za úkol předání vzkazu od DNA do jádra ribosomů • Transcribce - RNA je vytvořena z DNA • Translace – z RNA je přeložen vzkaz na výrobu proteinů • Díky Chargaffovu pravidlu se začlení pouze komplementární nukleotid, tudíž DNA polymeráza vytvoří perfektní kopii Chyba se stává! Mutace! Mutace • Substituce – jedna báze nahradí druhou • Inzerce – začlení se extra báze • Delece – ztráta jedné báze Genetický kód • Genetický kód– řeč mRNA s instrukcemi • Čtení třech písmen (dusíkatých bazí) zaráz • Kodón na mRNA; složen ze tří bazí • 64 kodonů pro 20 aminokyselin – jsou univerzální pro všechny bakterie, rostliny a živočichy na Zemi Co je gen? • Základní jednotka dědičnosti; dlouhá část DNA se specifickými instrukcemi pro produkci specifického proteinu • Geny se nachází na specifickém místě chromozomu zvaném lokus Chromozomální variace definuje druh • Chromozom je úložiště genetické informace, počet je druhově specifický • Lidský genom má ca. 3 million kb. • Ne-funkční kodony jsou introny • Funkční jsou exony