Bakteriální bioluminiscence Ondřej Vašíček ondrej.vasicek@ibp.cz Bakteriální bioluminiscence - obsah Základy bioluminiscence Historie bioluminiscence Bioluminiscenční bakterie Výskyt BL bakterií Biochemie reakce – luxoperon Využití bakteriální luminiscence Bioluminiscence Bioluminiscence je emise světla z biochemických reakcí, které se objevují v živých organismech. Při této reakci se vyzařuje až 96 % světla a jen 4 % tepla, je tedy z hlediska daných organismů velmi efektivní (pro porovnání, u výbojek je jen 10 %) https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning- center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/luciferase-reporters.html Bioluminiscence – fylogenetické rozšíření Bioluminiscence však je fylogeneticky rozšířený fenomén, který se rozvíjel nezávisle u mnoha živočichů a mikrobů http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev-marine-120308-081028 Bioluminiscence - rozšíření Obvyklá hlavně v hlubinách moří, kde obecně všichni živočichové emitují světlo http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev-marine-120308-081028 Bioluminiscence – charakteristické rysy 1. Probíhá v přítomnosti kyslíku 2. Vždy jsou zapotřebí dva typy látek: luciferin luciferáza (lucifer znamená přinášející světlo). Struktura a vlastnosti luciferázy a luciferinů se liší u jednotlivých skupin lumineskujících organismů 3. Luciferin je základním substrátem reakce 4. Luciferáza katalyzuje reakci 5. Někdy jsou luciferin a luciferáza navázány a tvoří jednotku nazvanou fotoprotein. Aktivita fotoproteinu je spouštěna dodáním určitého typu iontu (nejčastěji Ca2+). http://photobiology.info/LeeBasicBiolum.html Bioluminiscence - spektrum http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annu rev-marine-120308-081028 Bioluminiscence - funkce http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev-marine-120308-081028 http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev-marine-120308-081028 Bioluminiscence - funkce Bioluminiscence – historické milníky 1947 The energy source for bioluminescence in an isolated system. W.D. McElroy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 33: 342-345. Adenosine triphosphate (ATP) is an essential requirement for the in vitro reaction of firefly bioluminescence. 1953 The requirement of riboflavin phosphate for bacterial luminescence. W.D.McElroy, J.W. Hastings, V. Sonnefeld, and J. Coulombre. Science 118: 385-386. Reduced flavin mononucleotide (FMNH2) is one essential requirement being reduced by NADH. 1954 Isolation, identification, and function of long chain fatty aldehydes affecting the bacterial luciferin-luciferase reaction. B.L. Strehler and M.J. Cormier. J. Biol. Chem. 211: 213-225. 1955 Crystalline firefly luciferase. A.A. Green and W.D. McElroy. Biochim. Biophys Acta 20: 170-176. Firefly luciferase was purified as a protein with a mass around 100 kDa. 1961 The structure and synthesis of firefly luciferin. E.H. White, F. McCapra, G. Field, and W.D. McElroy. J. Amer. Chem. Soc. 85: 337-343. 1962 Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the hydromedusan, Aequorea. O. Shimomura, F.H. Johnson, and Y. Saiga. J. Cell. Comp.. Physiol. 59: 223-239. Aequorin was named a "photoprotein", as it required only Ca2+ and not oxygen for light emission. Bioluminiscence – historické milníky 1965 Cypridina bioluminescence. Structure of Cypridina luciferin. Y. Kishi, T. Goto, Y. Hirata, O. Shimomura, and F. H. Johnson. Tetrahedron Lett. No. 29, 3427-3436. 1969 Chemi- and bioluminescence of firefly luciferin. E.H. White, E. Rapaport, T.A. Hopkins, and H.H. Seliger. J. Amer. Chem. Soc. 91; 2178-2180. A red shifted bioluminescence induced by pH attributed to keto-enol tautomerism in the excited state. 1971 Mechanism of luminescent oxidation of Cypridina luciferin. O. Shimomura and F.H. Johnson. Biochem. Biophys. Res. Commun. 44: 340-346. A dioxetanone intermediate was proposed from product analysis of the reaction using oxygen-18. 1981 The use of the luminescent bacterial system for the rapid assessment of aquatic toxicity. A.A. Bulich and D.L. Isenberg. ISA Trans. 20: 29-33. This technical report was the basis of a patent, which resulted in the widest application of bioluminescence methodology. 1992 Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. D.C. Prasher, V.K. Eckenroad, W.W. Ward, and M.J. Cormier. Gene 111: 229-233. The result of this cloning, and later expression, of GPF was a revolution in biotechnology applications. Bioluminiscence https://www.youtube.com/watch?v=oKj FVBVGad0&t=1s https://www.youtube.com/watch?v=9H XXQBz6Vv0 Bakteriální bioluminiscence Bakteriální bioluminiscence Nejvíce se vyskytují v mořské vodě, některé jsou terestrické a sladkovodní. Rozlišujeme 4 rody: Vibrio, Photobacterium, Shewanella a Photorhabdus Vyskytují se jak samostatně, tak v symbióze s hostitelským organismem - nutný přísun potravy/energie Některé jsou i parazitické Bakteriální bioluminiscence - symbióza Ďas mořský (Lophius piscatorius, Linneaeus, 1758) První tři paprsky hřbetní ploutve jsou modifikovány v dlouhé útvary, připomínající tykadla. Na prvním se nachází světélkující útvar, který slouží jako návnada při lovu. Světélkování je zajištěno miliony bioluminiscenčních bakterií. https://www.spotmydive.com/es/news/el-lophiiforme-se-fusiona-para-reproducir Bakteriální bioluminiscence - symbióza Trnonoš (Monocentris japonica, Houttuyn, 1782) Bioluminiscenční bakterie využívány ke komunikaci mezi ostatními druhy. https://www.pinterest.de/pin/347129083762967396/ Bakteriální bioluminiscence http://photobiology.info/Lin.html Bakteriální bioluminiscence https://www.intechopen.com/books/biosensors/bacterial-bioluminescent-biosensor-characterisation-for-on- line-monitoring-of-heavy-metals-pollution Luminiscence je energeticky náročná (vysoká spotřeba ATP luciferázou), spotřebovává až 20% celkové buněčné energie (Nealson & Hastings 1979, Bassler & Silverman 1995). Bakteriální bioluminiscence – luxoperon http://photobiology.info/Lin.html Bioluminiscenční (lux) geny jsou podobné pro všechny BL bakterie. Zahrnují 5 genů: lux A a lux B jsou zodpovědné za alfa a beta podjednotky luciferázy lux C, D a E kódují komplex reduktázy mastných kyselin potřebné pro generování a recyklaci mastných kyselin na aldehyd (decanal). Bakteriální bioluminiscence – luxoperon Produkce luminiscence je těsně spjata s buněčným metabolismem a je tedy odrazem viability bakterií. http://photobiology.info/Lin.html Dva regulační geny: Gen lux I řídí syntézu N-acyl homoserin laktonu (HSL), signalizační molekuly známé jako autoinduktor potřebný pro aktivaci lux genů. Gen lux R kóduje syntézu N-acyl HSL receptoru - transkripčního faktoru odpovídajícího na Nacyl HSL signál. Receptor má DNA binding doménu a N-acyl HSL binding doménu. Hustota bakteriální suspenze je potřebná k dosažení kritické koncentrace autoinduktoru. Poté dojde k vazbě luxR produktu a transkripci luminiscenčních genů = Quorum sensing Bakteriální bioluminiscence – luxoperon http://photobiology.info/Lin.html Srovnání mechanismů regulace exprese lux genů u V. fischeri a V. harveyi Bakteriální bioluminiscence – luxoperon http://photobiology.info/Lin.html Regulace exprese lux genů u bioluminiscenčních bakterií Bakteriální bioluminiscence – aplikace Factory ovlivňující in vivo reakci: - genetická kontrola - koncentrace rozpuštěného kyslíku - koncentrace Mg2+ a Ca2+ iontů - intracelulární energetická rovnováha Ekotoxikologie Aplikace metody: - odpadní vody - čerstvá voda (povrchová i spodní) - slaná a brakická voda - sedimenty a výluhy - další vzorky rozpustné ve vodě Faktory ovlivňující bakteriální biolum. aktivitu: - optimální pH kolem 7 - změny v koncentraci NaCl - absorpce světla silným zabarvením vzorku - vysoká spotřeba kyslíku vzorkem Chemické, fyzikální a biologické toxikanty, které ovlivňují: - respiraci buněk - syntézu proteinů - syntézu lipidů - integritu buněk - a zvláště funkce buněčných membrán = > mají silný vliv na in vivo bioluminiscenci Bakteriální bioluminiscence – aplikace Výhody analýz - snadno proveditelné - finančně nenáročné - vysoce citlivé - široké spektrum aplikací - eticky akceptovatelné - toxicitu je možno vztáhnout i na vyšší organismy - malý objem analyzovaného vzorku - krátká doba provedení = rychlé výsledky - statisticky spolehlivé (vysoký počet testovaných organismů) Mezinárodní normy - Bestimmung der Hemmwirkung von Abwasser auf die Lichtemission von Photobacterium phosphoreum; Leuchtbakterien-Abwassertest mit konservierten Bakterien, DIN 38 412-L34 (L341) - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test), ISO/CD 11348 Bakteriální bioluminiscence – aplikace Figure: (A) Bioluminescent assay scheme; (B) Modified scheme of bioluminescent assay. The Light is bioluminescence intensity in relative units; Iс and Isam are maximum values of bioluminescence intensity in the presence of control or analyzed sample respectively; Tmax is the time when the coupled enzyme system reached the luminescence maximum; P is a time when the bioluminescent signal is absent due to an effect of redox active compounds in a sample. When analyzing toxicity of water samples, the luciferase index (LI) or toxicity coefficient (TC) are calculated according to the formulas: LI =(Isam /Ic) ·100 % TC = [(Ic – Isam)/ Ic] ·100 % TC = 100 - LI LI and TC are the residual luminescence and the degree of inhibition, respectively, of the bacterial coupled enzyme system Red + Luc in the presence of the analyzed sample. The criterion of toxicity is a 50 % decrease in the maximum of light emission for the bacterial coupled enzyme system Red + Luc after the analyzed sample is added. To compare the toxicity of individual substances, values used for TC are the 50% and 20% loss of luminescence for the coupled enzyme system Red + Luc. http://photobiology.info/Kratasyuk.html Bakteriální bioluminiscence – aplikace Potřebné vybavení: - luminometr (přenosný) - kyvety nebo mikrotitrační destičky - kultura bakterií - NaCl - čistá (redestilovaná) voda Pracovní postup – zjednodušený protokol: - Připrav (odeber) vzorek - Nastav salinitu a pH (pokud je to nutné) - Připrav si několik ředění vzorku - Připrav kulturu bakterií, stabilizuj ji - Pipetuj bakterie do zkumavek - Změř bioluminiscenci - Přidej vzorek a inkubuj (podle bakt. kultury 15 nebo 30 minut nebo i déle) - Změř bioluminiscenci po inkubaci - Vypočítej výsledky (EC50) Bakteriální bioluminiscence – aplikace EC50 – Efektivní koncentrace (ppm - parts per million) toxikantů, které působí 50% inhibici luminiscence Bakteriální bioluminiscence – aplikace Typové kultury rodu Photorhabdus z CCM Brno: Photorhabdus asymbiotica CCM 7074T - izolace z lidského poranění, Texas Photorhabdus luminescens ssp. akhurstii CCM 7075T - izolace z Heterorhabditis indica, Guadeloupe Photorhabdus luminescens ssp. laumondii CCM 7076T - izolace z Heterorhabditis bacteriophora, Trinidad a Tobago Photorhabdus luminescens ssp. luminescens CCM 7077T - izolace z Heterorhabditis bacteriophora, Australia Photorhabdus temperata CCM 7078 T - izolace z Heterorhabditis megilis, Rusko Bakteriální bioluminiscence – aplikace Escherichia coli K 12 (pEGFPluxABCDEamp) E.coli-lux luxA luxB luxC luxD luxE amp EGFP pEGFPluxABCDEamp FMNH2 + RCHO + O2 → FMN + RCO2H + H2O + Luciferase Fatty acid metabolism light Bioluminescence Photorhabdus luminescens Toxikologie Literatura http://photobiology.info/#Biolum http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev-marine-120308-081028 John Lee - http://tube.sfu-kras.ru/video/1134 Děkuji za pozornost