Bioluminiscence živočichů Ondřej Vašíček ondrej.vasicek@ibp.cz Bioluminiscence Bioluminiscence je emise světla z biochemických reakcí, které se objevují v živých organismech. Při této reakci se vyzařuje až 96 % světla a jen 4 % tepla, je tedy z hlediska daných organismů velmi efektivní (pro porovnání, u výbojek je jen 10 %) https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning- center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/luciferase-reporters.html Bioluminiscence – charakteristické rysy 1. Probíhá v přítomnosti kyslíku 2. Vždy jsou zapotřebí dva typy látek: luciferin luciferáza (lucifer znamená přinášející světlo). Struktura a vlastnosti luciferázy a luciferinů se liší u jednotlivých skupin lumineskujících organismů 3. Luciferin je základním substrátem reakce Bioluminiscence – charakteristické rysy http://photobiology.info/LeeBasicBiolum.html 5. Někdy jsou luciferin a luciferáza-like protein navázány a tvoří jednotku nazvanou fotoprotein. Aktivita fotoproteinu je spuštěna, když určitý iont je dodán do systému Tímto iontem je většinou vápník 4. Luciferáza katalyzuje reakci. Luciferin je buď: v organismech syntetizován nebo je dodáván v potravě Bioluminiscence - rozšíření Obvyklá hlavně v hlubinách moří http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annu rev-marine-120308-081028 Bioluminiscence - funkce http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev-marine-120308-081028 http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev-marine-120308-081028 Bioluminiscence - funkce Bioluminiscence živočichů http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev-marine-120308-081028 Bioluminiscence živočichů http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev-marine-120308-081028 Dinoflagellata (= Obrněnky) tetrapyrrole - Planktonní bičíkovci hojní v teplých mořích. Luciferin je zde pravděpodobně odvozen od chlorofylu, který má podobnou strukturu - Noctiluca miliaris, N. scintilans, Pyrocystis fusiformis, Gonyaulax sp. Noctiluca sp. http://www.bbc.com/news/science-environment- 21144766 Pyrocystis sp. Gonyaulax sp. Dinoflagellata (= Obrněnky) http://tolweb.org/notes/?note_id=5621 U rodu Gonyaulax, při pH 8 je molekula luciferinu „chráněna" před luciferázou pomocí "luciferin-binding protein", když pH klesne, volný luciferin může reagovat a světlo je produkováno. Fungi (= Houby) http://photobiology.info/Viviani.html - Houby využívají bioluminiscence především k přilákání bezobratlých, aby si zajistili šíření spór do širokého okolí. - Mechanismus bioluminiscence je dvou krokový - Omphalotus sp., Armillaria sp., Mycena sp. Panellus sp., Locellina sp. Cnidaria (= Žahavci) Coelentrazin - Typickým luciferinem je Coelenterazin, Je to obecně nejrozšířenejší mořský luciferin nalezený v mnoha živočišných taxonech. - Molekula luciferinu se může objevit v komplexu (fotoprotein nazvaný aequorin) - Cílem bioluminiscence je přilákat kořist - Scyphozoa (medůzovci), Hydrozoa (polypovci) a Anthozoa (korálnatci) AnthozoaScyphozoa Aequorea victoria Cnidaria (= Žahavci) - Aequorin – využití pro analýzu Ca2+ - Je fotoproteinový komplex izolovaný z medúzy Aequorea (a jiných mořských druhů). - Funkční komplex = apo-aequorin (protein) + molekulární kyslík + luciferin coelenterazin. - Když se Ca2+ naváže na komplex, coelenterazin je oxidován na coelenteramide při uvolnění CO2 a modrého světla (469 nm). Cnidaria (= Žahavci) Žahavci mohou krom Aequorinu emitovat světlo přes green fluorescent protein (GFP) Př. Aequorea victoria - okraj zvonu Cnidaria (= Žahavci) Annelida (= Kroužkovci) Diplocardia longa Verdes A. and D. F. Gruber 2017, Glowing Worms: Biological, Chemical, and Functional Diversity of Bioluminescent Annelids Mollusca (= Měkkýši) Pholas dactylus - skulař vrtavý - Rod Pholas je nejdéle zkoumaným rodem. Objevem pholasin, který je strukturně velice podobný coelenterazinu. - Využití v detekci produkce ROS Watasenia sp. Hinea brasiliana Staurotheutis sp. Crustacea (= Korýši) - Vargula hilgendorfii má dvě luminiscenční žlázy schopné rychle vystříknout luciferin a luciferázu do mořské vody, za účel vylekat jejich predátory. - U tohoto druhy byl nalezen luciferin Vargulin (Cypridina). Vargula hilgendorfii Oplophorus sp. Korýši/Ryby - Vargulin je rovněž používán rybou Porichthys. - Zde je přímá souvislost s potravou – ryba emituje BL pouze tehdy, přijímá-li potravu nesoucí vargulin. - Luciferin a luciferáza reagují ve zvláštních buňkách nazývaných photocyty. Tyto buňky jsou buď různě rozmístěny ve tkáních organismu, nebo seskupené v jednom specializovaném orgánu, nazývaném photophory. - Jedna ryba má kolem 700 photophorů. Paitio J., Oba Y. and Meyer-Rochow V.B., 2016, Bioluminescent Fishes and their Eyes Paitio J., Oba Y. and Meyer-Rochow V.B., 2016, Bioluminescent Fishes and their Eyes Millipedes (= Mnohonožky) Mytoxia sp. http://www.apheloria.org/Paul_Marek/Aposematism.ht ml Luminodesmus sequoiae 7,8-dihydropterin-6-carboxylic acid Diptera (= Dvoukřídlí) - Jedná se předdevším o rody Arachnocampa (Arachnocampa luminnosa) Orfelia (Orfelia fultoni) Arachnocampa luminnosa Orfelia fultoni Coleoptera (= Brouci) - Známo více jak 200 druhů především reprezentováno rody Lampyridae sp., Phengodidae sp. a Elateridae sp. - Svítit dokáží nejen létající samečci a na zemi žijící samičky, ale i larvy. Mnohdy svítí i vajíčka. Samičky mají více světelných orgánů než samci. - Světélkování dospělců („sexy-svit”) umožňuje sblížení jedinců, kteří si způsobem svícení vzájemně imponují. Samci létají se slabým svícením a hledají si samičky, které leží v trávě a svítí velmi výrazně. - Světlo také napomáhá vymezovat teritorium a upozorňuje i na nebezpečné překážky (pavučina, voda). (A) Cratomorphus sp. (Lampyridae); (B) Phrixotrix sp. (Phengodidae); (C) Pyrophorus sp. (Elateridae). Coleoptera (= Brouci) Regulace emise světla světluškami: - Vzplanutí nervové aktivity stimuluje uvolnění primárního neurotransmiteru - octopaminu. - To spouští světelný orgán lokalizovaný na zadečku, který obsahuje tisíce fotocytů s organelami obsahujícími luciferin a luciferázu. - Ty reagují a emitují světlo, pokud je přítomen kyslík. Ten je dodáván z mitochondrií přítomných na koncích fotocytů. Které faktory kontrolují emisi světla ? - Kyslík proudí do mitochondrií fotocytů. Nějaká látka musí regulovat oxidaci luciferinu a luciferázy ve fotocytech, pokud světluška chce/nechce svítit. - mitochondriální spotřeba kyslíku je konečný kontrolní bod pro odstranění veškerého kyslíku, který dosáhne fotocytů. - V odpovědi na neuronální excitaci je uvolňován NO – ten inhibuje extrakci kyslíku mitochondriemi. - To dovoluje kyslíku oxidovat luciferin. Coleoptera (= Brouci) Světlo je Neurotransmiter octopamin activuje „lantern“ NO syntázu (NOS), která produkuje NO. NO difunduje rychle a inhibuje zpracování kyslíku mitochondriemi fotocytů. Kyslík dodávaný tracheolami difunduje do peroxisomů a spouští reakci produkující světlo. Světlo není Kyslík je dodáván „lanternovým tracheolárním systémem“ a je konzumován mitochondriemi fotocytů To způsobuje hypoxii cytoplasmy fotocytů a brání kyslíku, aby dosáhl peroxisomů (organel obsahujících luciferin a luciferázu). ATP produkovaný oxidativní fosforylací je zapotřebí k formování a akumulaci aktivovaného luciferyl-adenylát meziproduktu (označený jako Luciferin*). Využití bioluminiscence živočichů Escherichia coli K 12 (pEGFPluxABCDEamp) E.coli-lux luxA luxB luxC luxD luxE amp EGFP pEGFPluxABCDEamp FMNH2 + RCHO + O2 → FMN + RCO2H + H2O + Luciferase Fatty acid metabolism light Bioluminescence Photorhabdus luminescens Toxikologie Využití bioluminiscence živočichů Luciferase Reporter Assay http://photobiology.info/Ohmiya.html Principle of multicolor luciferase reporter assayPrinciple of a simple luciferase reporter assay Využití bioluminiscence živočichů http://photobiology.info/Ohmiya.html Principle of calcium ion and ATP monitoring using photoprotein and beetle luciferase Využití bioluminiscence živočichů http://photobiology.info/Ohmiya.html In vivo bioluminescence imaging using luminescent living cells and antibody-fused luciferase probe In vivo assay Děkuji za pozornost