Fotobiologie
Milan Číž
Lukáš Kubala
Ondřej Vašíček
Fotobiologie
Sylabus (podzim 2019)
Datum Přednáška Přednášející
17. 9. Úvod Číž
24. 9. Světlo a organismy Číž
1. 10. Bioluminiscence živočichů Vašíček
8. 10. Bakteriální bioluminiscence Vašíček
15. 10. Nevizuální fotorecepce Číž
22. 10. Vidění Číž
29. 10. Fotodermatologie 1 Kubala
5. 11. Fotodermatologie 2 Kubala
12. 11. Fotomedicína Kubala
19. 11. Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Číž
26. 11. Fotodynamická terapie Kubala
Fotobiologie
Fotobiologie je biologickou vědní disciplínou, která studuje
interakce světla (a neionizujícího elektromagnetického záření)
s živými organismy.
Zahrnuje prospěšné i škodlivé účinky světla.
Fotobiologové studují:
- mechanismy těchto interakcí
- jejich využitelnost pro léčbu chorob
- jak chránit organismus před škodlivými účinky světla
Důležitost světla (neionizujícího záření) je patrná z počtu Nobelových
cen udělených za výzkum v oblasti fotobiologie
1903 Niels R. Finsen - Physiology/Medicine: Phototherapy of lupus vulgaris and other diseases.
1911 Allvar Gullstrand - Physiology/Medicine: Dioptrics (image formation) of the eye.
1915 Richard M. Willstatter - Chemistry: The chemistry of chlorophyll and other plant pigments.
1930 Hans Fischer - Chemistry: The chemistry of heme pigments including chlorophyll.
1937 Paul Karrer - Chemistry: Studies on carotenoids, flavins and vitamins A and B2.
1938 Richard Kuhn - Chemistry: The chemistry of carotenoids and vitamins.
1961 Melvin Calvin - Physiology/Medicine: Carbon dioxide assimilation in plants (dark reactions).
1967 Ragnar Granit, Haldan K. Hartline, George Wald - Physiology/Medicine: Neurophysiology and the
biochemistry of vision.
1981 David H. Hubel, Torsten N. Wiesel - Physiology/Medicine: Information processing in the visual
system.
1988 Johann Deisenhofer, Robert Huber, Hartmut Michel - Chemistry: Structure of the photosynthetic
reaction center.
1992 Rudolph A. Marcus - Chemistry: Theory of electron transfer reactions in chemical systems.
1995 Paul J. Crutzen, Mario J. Molino, F. Sherwood Rowland - Chemistry: Decomposition of
stratospheric ozone by UV radiation.
1999 Ahmed Zewailv Chemistry: - Femtosecond spectroscopy of transition states.
2002 John B. Fenn, Koichi Tanaka, Kurt Wuthrich - Chemistry: NMR and mass spectroscopy of
biological molecules.
2008 Martin Chalfie, Osamu Shimomura, and Roger Y. Tsien - Chemistry: Discovery and development
of the green fluorescent protein.
Podobory fotobiologie
Obor fotobiologie se rozděluje do cca 12 podoborů
11 podoborů se týká absorpce světla
1 podobor se naopak týká emise světla živými organismy
(bioluminiscence)
1. Fotofyzika
Fyzikální interakce světla (a neionizujícího EM záření) s
materiály na atomové a molekulární úrovni.
Fotofyzikální reakce zahrnují:
 Rozptyl
 Absorpci
 Formování excitovaných stavů
Význam podoboru:
Výzkum podstaty fotochemických a fotofyzikálních dějů a
aplikace získaných poznatků pro pochopení fotobiologických
dějů.
2. Fotochemie
Studium chemických změn, které se objeví v molekulách po
přímé absorpci světla, a reakcí mezi molekulami absorbujícími
světlo s molekulami okolními.
Příklad:
Tvorba fotochemického smogu v troposféře (spodní vrstva
atmosféry). Fotochemický smog je výsledkem interakce UV
záření (ze slunečního světla) s oxidy dusíku a uhlovodíky
především z výfukových plynů.
Fotochemický smog vyvolává podráždění očí a špatnou
viditelnost.
3. Fotosensitizace
Je to proces, ve kterém se v jedné nebo více molekulách
projeví fotochemické a fotofyzikální alterace jako následek
absorpce světla v jiné molekule nazývané fotosensitizér.
Prakticky všechny organismy obsahují endogenní molekuly –
potencionální fotosensitizéry.
Porfyriny v biosyntéze hemu (metaloporfyrin vázající Fe2+,
Fe3+)
Hem je nejvýznamnějším metaloporfyrinem. Tvoří
prostetickou skupinu v mnoha životně důležitých molekulách a
enzymech, jako jsou například:
• Hemoglobiny
• Myoglobiny
• Cytochromy (Cytochrom c, Cytochrom P-450)
• Katalázy
Fotodynamická terapie využívá fotosensitizující léky a světlo.
Používá se především v nádorové terapii (např. nádory plic,
jícnu) – destruuje nádorové buňky.
4. Účinky UV záření
Fotofyzikální a fotochemické změny vyvolané účinkem UV
záření na DNA, RNA a proteiny.
Biologické důsledky těchto změn (letalita, mutace).
Biochemické a molekulárně biologické pochody vedoucí k
nápravě fotochemicky poškozené DNA.
Snížená hladina ozónu ve stratosféře vede ke zvýšené intenzitě
UV záření > zvýšení zájmu o tyto efekty a jejich prevenci.
UV záření je dobře známý zdroj různých forem rakoviny kůže.
V současné době se intenzívně diskutuje podíl UV-B (280-320
nm) a UV-A (320-400 nm) na vzniku melanomu. Výsledky
jsou využitelné ve výrobě protektivních prostředků.
5. Environmentální fotobiologie
Efekt radiace na celé organismy a na přežívání, složení a
produktivitu druhů v přírodě, zemědělství a různých
ekosystémech.
6. Fotomedicína
Zabývá se účinky záření na lidské zdraví a využitím záření pro
léčbu chorob.
Zahrnuje:
 vznik nádorů po UV radiaci
 modulaci imunitního systému zářením (fotoimunologie)
 léčení SAD (Seasonal Affective Disorder) světelnou terapií
 použití světla spolu s fotosensitizéry k léčení chorob jako
psoriáza, nádory apod.
7. Nevizuální fotorecepce, Fotoperiodismus
Světlo je vnímáno receptorem, aniž by byl vytvářen obraz jako
v případě vizuální fotorecepce.
Důsledkem jsou cyklické změny ve fyziologii a chování.
8. Vidění
Vidění je smyslovým vjemem, který je zprostředkovaný okem
a centrálním nervovým systémem živočichů. Tento systém
umožňuje vnímání tvaru objektů.
Podobor zahrnuje:
 zkoumání struktury a fotochemie pigmentů
 biochemické a fyziologické změny, které následují po
aktivaci pigmentů vidění
 psychofyziku – vliv světla na mentální procesy
9. Fotomorfogeneze
Zabývá se vlivem radiace na vývoj organismů, typicky na
vývoj rostlin a hub (zrání semen, vývoj květů, indukce a vývoj
reprodukčního ústrojí u hub).
Různé rostliny vyvíjejí květy v různých ročních obdobích. Je
to způsobeno interakcí druhově specifických molekul s
fytochromy – důležitými fytomorfogenetickými pigmenty u
rostlin.
10. Fototaktický pohyb
Radiace kontroluje pohyb mnoha rostlin, mikrobů, hub a
nižších živočichů.
Příkladem je fototropismus – otáčení rostlin za sluncem.
Fototaxe – je to pohyb mobilního organismu vzhledem ke
směru světla.
11. Fotosyntéza
Fotosyntéza je proces transdukce energie, ve kterém je
sluneční energie konvertována na energii biochemickou.
Objevuje se u rostlin a některých mikrobů.
Tento proces zahrnuje absorpci světla chlorofylem nebo jinými
pigmenty, transfer energie do jiných molekul a akumulaci
energeticky bohatých molekul (škrob).
12. Bioluminiscence
Bioluminiscence je emise světla z biochemických reakcí, které
se objevují v živých organismech.
Nejznámější příklad - světluška.
Bioluminiscence však je fylogeneticky rozšířený fenomén,
který se rozvíjel nezávisle u mnoha živočichů a mikrobů.
Světlo
Je formou energie. Ke vzniku světla je zapotřebí dodat jinou formu
energie. Obvykle se tak děje dvěma způsoby:
II. Luminiscence
Je „studené světlo„ vznikajících při fyziologických nebo nižších
teplotách. Dodaná energie „vykopne“ elektron z atomu do vyšší
energetické hladiny (excitovaný stav). Poté elektron vyzáří dodanou
energii ve formě světla a vrátí se zpět do základního stavu.
I. Incandescence
Je světlo vzniklé z tepelné energie (vlákno v žárovce, pec, slunce)
Existuje několik způsobů luminiscence:
1. Fluorescence a Fotoluminiscence – energie je dodávána
elektromagnetickým zářením.
Fotoluminescencí je nazývána jakákoliv luminiscence z
elektromagnetického záření.
Fluorescence je luminiscence vyvolaná UV zářením.
2. Chemiluminiscence - energie je dodávána chemickou reakcí.
3. Bioluminiscence - energie je dodávána chemickou reakcí v
živých organismech.
4. Elektroluminiscence - je způsobená elektrickým proudem
(katodoluminiscence).
Další příklady:
5. Radioluminiscence
6. Triboluminiscence - spuštěna mechanicky (tlakem)
7. Fosforescence (opožděná luminiscence) - tzv. zakázaný přechod
mezi stavy atomu - elektrony se zpožděně dostávají do
základního stavu.
Světlo je nezbytná součást fotosyntézy – světlo je nezbytné pro
růst rostlin.
Světlo interaguje s buňkami oční sítnice – podstata vidění.
Fotomedicína je lékařským oborem zabývajícím se použitím
světla k zlepšení lidského zdraví. Fototerapie je použití světla k
léčení různých chorob (rakovina, leukemie, kožní choroby).
Některé organismy (luminiscenční bakterie, světlušky) vyzařují
světlo jako výsledek chemických reakcí odehrávajících se ve
specializovaných orgánech.
Hlavní biologické účinky světla
Intensita světla během dne má vliv na tvorbu hormonů, vitamínu
D v kůži atd., může ovlivňovat chování.
Světlo může mít škodlivé účinky na organismy – např. nadměrné slunění může
vyvolat rakovinu kůže, předčasné stárnutí kůže, poškození očí apod.
UV světlo může indukovat mutace a změněné exprese genů.
Hlavní biologické účinky světla
Sluneční záření je elektromagnetické vlnění.
Rozsah působení a vedlejších účinků je závislý:
- na vlnové délce
- na dávce ozáření
Čím je vlnová délka kratší, tím má záření větší energii.
Záření, které dopadá na zemský povrch, je velmi odlišné od
záření, které slunce vlastně vyzařuje.
Sluneční záření, které se vyskytuje vně zemské atmosféry, se tam
rozptyluje, odráží se od mraků a je absorbováno různými částmi
atmosféry (vodní páry, ozón, kyslík, aerosoly).
James Clerk Maxwell (1864) ukázal, že elektrické a magnetické
vlny jsou vyzařovány současně a mají stejnou rychlost. Světlo
tvoří pouze malou část elektromagnetického spektra.
Einstein objevil, že světlo (a jiné druhy elektromagnetické
radiace) se šíří jako malá světelná kvanta, nebo také fotony.
Energie fotonu je proporcionální jeho frekvenci.
elektromagnetické vlnění magnetické pole
elektrické pole
Frekvence (n)
Vlnová délka (l)
Vlnová délka (l, nm)
Viditelné spektrum
g paprsky paprsky X UV IR mikrovlny dlouhé rádiové vlny
rádiové vlny
Vlnová délka (nm)
Intenzitazáření(W/m2/nm)
UV Viditelné Infračervené
Intenzita záření před vstupem do atmosféry
Absolutně černé těleso (5250 K)
Intenzita záření na hladině moře
Absorpční
pásy
Spektrum solárního záření před (žlutě) a po (červeně) průchodu
atmosférou (na hladině moře). Tato distribuce poměrně dobře
odpovídá modelu vyzařování absolutně černého tělesa (popsaného
Wienovým posunovacím zákonem) při teplotě asi 5250 K, což je
teplota, která přibližně panuje na povrchu Slunce.
Jablonského diagram – schématické znázornění energetických
hladin molekuly během fotochemických dějů.
Omezíme-li směr kmitání vektoru E nebo jeho velikost, získáme
polarizované světlo. Přitom rozdíl mezi polarizovaným a
nepolarizovaným světlem nepoznáme okem. Lidské oko nedokáže
polarizované světlo od nepolarizovaného světla odlišit.
Příklad:
Lineárně polarizované světlo - vektor kmitá stále v jedné přímce
Polarizované světlo
Koherentní světlo je světlo složené ze světel, která mají v
určitém místě a určitém okamžiku stejnou vlnovou délku a
stejnou fázi. Běžné zdroje vyzařují světlo nekoherentní, laser je
zdrojem světla koherentního.
sluneční světlo (mnoho různých barev)
LED (monochromatické, nekoherentní)
laser (monochromatické, koherentní)
Vlnová délka
Pro elektromagnetické vlnění se délka vlny jednoduše spočítá
vzorcem:
λ = c / f
kde:
λ ... vlnová délka
c ... rychlost světla (300 000 km/s)
f ... frekvence
Výzkum ve fotochemii, fotobiologii a biologických vědách vůbec
se neobejde bez spektroskopických metod.
Nejpoužívanější jsou:
 absorpce
 fluorescence
Beer-Lambertův zákon:
Lambertův zákon – podíl světla absorbovaného materiálem je
nezávislý na intenzitě radiace.
Beerův zákon – absorpce je proporcionální koncentraci vzorku.
A = log Io/It
Obsahuje-li kapalina nerozpuštěné pevné částice, pak je světlo
procházející kapalinou pohlcováno a zároveň rozptylováno,
přičemž stupeň zákalu je ovlivňován jak velikostí a tvarem
pevných částic, tak jejich poměrným zastoupením.
Nefelometr měří rozptýlené světlo většinou pod úhlem (zpravidla
90°).
Nefelometrie (nefelometr = zákaloměr)
Příbuzná technika k nefelometrii založená na měření rozptylu
světla v roztoku obsahujícím dispergované částice. Měří se úbytek
intenzity světla jako výsledek rozptylu, absorpce nebo odrazu
světla.
Volba metody:
Závisí na stupni rozptylu světla.
je-li velký - turbidimetrie
je-li malý - nefelometrie
Turbidimetrie
Fluorescence
Emisní vlnová délka je větší než excitační, emisní energie menší.
Některé látky mají přirozenou fluorescenci, pro sledování
biologických dějů se používají látky s intenzívní fluorescencí –
fluorofory.
Fluorescence může být vizualizována fluorescenčním
mikroskopem nebo konfokálním mikroskopem.
Energie
Speciální fluorescenční techniky
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
používaná pro studium interakce proteinů
fluorescence
donoru
absorbce
akceptoru
vlnová délka (l)
Speciální fluorescenční techniky
Fluorescence photobleaching: FRAP and FLIP
Používané pro studium dynamické distribuce proteinů. V obou
případech je fluorescence určité oblasti eliminována zářením
vysoké intenzity.
Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)
- je sledován návrat fluorescence do vyhaslé oblasti
Fluorescence loss in photobleaching (FLIP)
– určitá oblast je opakovaně vyhasínána. Je sledováno naopak
vyhasínání fluorescence v jiných oblastech