FOTODYNAMICKÁ TERAPIE 1 Lukáš Kubala DFRP BFÚ AV ČR Fotodynamická terapie (PDT) je jednou z možností léčby jak nádorového onemocnění (zejména u adjuvantní léčby) tak i řady nenádorových onemocnění, především kožních lézí a očních chorob. Základem pro fotodynamickou terapii je fotochemická reakce Nutnou podmínkou pro vyvolání fotochemické reakce je, aby alespoň jedna z reakčních složek absorbovala dopadající světelné záření. Vzhledem k tomu, že molekulární kyslík neabsorbuje světlo o vlnových délkách vyšších než 200 nm, musí být absorbující složkou oxidovaný substrát. Absorbuje-li substrát iniciující záření, může dojít k přímé fotochemické oxidaci, a to dvojímmechanismem: a) Absorpcí světla substrátem vznikají volné které reagují přímo s dikyslíkem. Podle novějších názorů se může molekulární kyslík při vzniku radikálů účastnit jako akceptor elektronu. Tato reakce je spinově dovolená. b) Absorpcí excitovaného molekulárním světla se substrát dostává do tripletového stavu a reaguje přímo s kyslíkem. Reakce dvou částic v tripletovém stavu je rovněž spinově dovolená. Přímá fotochemická reakce Při přímé fotochemické reakci se množství absorbovaných světelných kvant mění s časem v důsledku poklesu koncentrace reagující složky a vzrůstu koncentrace reakčních produktů. Aktivační energie fotochemického procesu je velmi malá. Nepřímá fotochemická reakce Pokud žádná z reakčních složek neabsorbuje světlo, je možno k reakčnímu systému přidat další, v podstatě inertní, ale světlo absorbující složku - senzibilizátor, který umožní nepřímou fotochemickou oxidaci. Prakticky všechny organismy obsahují endogenní molekuly – potencionální fotosensitizéry. Jako senzibilizátory se většinou užívají organická barviva. Senzibilizující látka může rovněž vznikat v průběhu termické nebo fotochemické reakce. Fotosenzibilizované reakce mohou probíhat dvěma různými mechanismy. 1. Senzibilizátor, který se absorpcí světla dostal do tripletového stavu, může převést získanou energii na molekulu substrátu za vzniku volného radikálu nebo molekuly substrátu v tripletovém stavu. 2. Senzibilizátor, který se absorpcí světla dostal do tripletového stavu, může převést získanou energii na molekulu kyslíku za vzniku singletového kyslíku. Je to proces, ve kterém se v jedné nebo více molekulách projeví fotochemické a fotofyzikální alterace jako následek absorpce světla v jiné molekule nazývané fotosensitizér. Fotosensitizace SVĚTLO KYSLÍK PDT FOTOSENSIBILIZÁTOR BUNĚČNÉ POŠKOZENÍ BUNĚČNÁ SMRT Princip fotodynamické terapie PRINCIPLES OF PHOTODYNAMIC THERAPY hν SENSITIZER → 1 SENSITIZER * 1 SENSITIZER* → 3 SENSITIZER* TYPE I MECHANISM 3 SENSITIZER* + 3 SENSITIZER* 3 SENSITIZER* + SUBSTRATE → SENSITIZER +. + SENSITIZER -. → SUBSTRATE +. + SENSITIZER -. SENSITIZER + O2 -. SENSITIZER -. + O2 (3 Σg ) → SUBSTRATE +. + O2 (3 Σg ) → OXIDATIVE DAMAGE SUBSTRATE + O2 -. → OXIDATIVE DAMAGE TYPE II MECHANISM 3 SENSITIZER* + O2(3 Σg ) → SENSITIZER + O2(1 ∆g) O2 (1 ∆g) + SUBSTRATE → OXIDATIVE DAMAGE Fotodynamický účinek na živé organismy Nejcitlivější jsou jednobuněčné organismy, neboť nejsou chráněny kůží. Kromě akridinu, užitého Raabem, byly jako senzibilizátory používány například: akridinová oranž, akridinová červeň, methylenová modř a novome-tylenová modř, fenazin, trypaflavin, fluorescein, eosin, erytrosin, rhodamin B, naftochinony, antrachinony, chlorofyly, sulfonamid, 3,4 - benzopyren, perlonin. U bakterií byla většinou pozorována ztráta antigenity, při silnějším účinku mutagenní a letální účinek, a to za přítomnosti různých barviv. U savců je při fotodynamickém účinku ovlivněn jen vnější povrch, protože pronikání světla je omezeno jen na relativně tenkou vnější vrstvu. Primární efekt v kůži může být doprovázen zřetelnými sekundárními efekty ve vzdálenějších orgánech, t.j. v orgánech cirkulačních a dýchacích a v centrálním nervovém systému. Dále mohou podléhat fotodynamickému jevu všechny tělní tekutiny. Při senzibilaci teplokrevných zvířat může však docházet k značnému zeslabování účinku redukcí barviv v organismu, případně srážením jejich komplexů s bílkovinami. Tím se může stát, že běžně užívané nízké koncentrace ( 1O-4 - 1O-6 M) jsou in vivo neúčinné. Fotodynamický účinek na živé organismy U rostlin byl fotodynamický jev studován mnohem méně než u živočichů. Při ozařování semen máčených v roztocích fotodynamicky účinných barviv bylo pozorované zvýšení klíčivosti. Fotodynamický účinek na živé organismy Ch. Darwin a K. Dammann popsali i negativní vlivy slunečního záření za přítomnosti „drog“ – vyrážku u zvířat po požití pohanky (objevovala se u zvířat se světlejší srstí a po delším pobytu naslunci) 1895 – Dieudonneé - popisoval baktericidní účinky kyslíku (ale neuvažoval katalytický vliv fotosensibilizátoru) 1900 - J. Prime – otoky prstů, puchýře u epileptiků léčených eosinem (obsahuje bromid jakožto potenciální antiepileptickousoučást) 1900 - O. Rabb – vliv akridinu na prvoky (nálevníci - stanovoval prahovou hranici toxicity barviv, provedl cca 800 experimentů, které však byly nereprodukovatelné) O. Rabb a Tappeiner– akridin, eosin, chinin – toxicita se lišila v průběhu dne. Usoudili na vliv fluorescence barviv a označili reakci jako fotodynamickou 1904 Ledoux-Lebards dokázal, že pro fotodynamickou reakci je nutná přítomnost kyslíku (trepky rychleji umírají v otevřené lahvi za přítomnosti kyslíku než v lahvi uzavřené). 1909 – také Von Tappeiner navzdory svým minulým pracem prohlásil, že kyslík je zodpovědný za fotodynamický efekt. A aniž znal mechanismus tohoto jevu, již v roce 1903 započal experimenty na lidech (rakovina, syfilis, tuberkulóza). Dyer používal erythrosin, antibakteriální účinky, lupenka (ale pacienti trpěli silnými bolestmi a proto experimenty ukončil) Historie výzkumu fotodynamického jevu a terapie SClENCHSl Friedrich Meyer-Betz, a German physician, injected himself with porphyrin in 1912 to test whether it made human sensitive to light. The first photograph shows him four days later, after he took a walk on a sunny day. Most of the swelling subsided by the sixth days (second photograph) but he remained light-sensitive for several months. 1973 Thomas Dougherty zveřejnil práci o zhoršené rychlosti růstu transplantovaných prsních nádorů u myší po senzibilizaci fluoresceinem a světlem při 488 nm. Poté stanovil kritéria pro vhodný fotosenzibilizátor pro PDT Ne toxická při terapeutické dávce Definovaný příjem a akumulace v maligní tkáni Aktivace světla nad 600 nm Fotochemická aktivita Fotodynamicky účinná barviva Senzibilizační účinnost, t.j. schopnost využít světelnou energii, byla zjištěna u řady barviv nejrůznější chemické struktury. Typ reakce není určován povahou barviva, ale podmínkami v systému, v němž reakce nastává. U řady azinových, fluoresceinových, rostlinných barviv byla fotodynamická účinnost potvrzena na nejrůznějších substrátech, o fotodynamické účinnosti jiných barviv se údaje rozcházejí. Mezi nejúčinnější fotosenzibilizátory patří metylenová modř a eosin, jejichž mechanismus účinku byl také nejvíc prostudován. Tato barviva byla spolu s hematoporfyrinem, chlorofylem a riboflavinem také nejčastěji používána pro studium PDT. Třezalka tečkovaná Považovala za kouzelnou rostlinu a sloužila při léčení neobyčejných nemocí - náměsíčností počínaje a úderem blesku konče. Dokládají to i lidové názvy, říkalo se jí čarovník, prostřelenec, svatojanská bylina nebo třeba krevníček. Dva poslední názvy nejspíš souvisí s hypericinem, červeným barvivem, které je obsaženo v kanálcích v listech a jemuž se říkalo krev sv. Jana a zřejmě právě ono má také na svědomí pověry a legendy, opřádající tuto bylinu. Třezalka tečkovaná Hypericum perforatum L Porphyrins Chlorins Phthalocyanines AIPcS4 - tetrasulfonated aluminum phthalocyanine mTHPC (Foscan®) - m-tetrahydroxyphenylchlorin znám především pro hypericismus, tedy podráždění pokožky, horečky, často s následkem smrti • absorbuje při 590 nm • lupenka, rakovina kůže, bradavice Hypericin • Používá se již staletí (např. barvení bakteriálních kmenů, diagnostika, marker nádorů) • Inaktivuje viry • Nevýhoda: je redukována buněčnými enzymy na bezbarvou a tedy fotodynamicky neúčinnou formu Methylenová modř Verteporfin (Visudyne) • Absorbuje při 690 nm • Velmi rychle je absorbován nádorovou tkání; optimální koncentrace v této tkáni je dosaženo 30-150 minut po intravenózní aplikaci • Fotosensitizace pokožky se projevuje jen několik dnů • Kožní nádory (ale ne melanomy), lupenka, revmatická artritida Kyselina 5-aminolevulová Prekursor Protoporphyrinu IX Tin etiopurpurin (Puryltin TM) Farmakologické využití na léčbu: rakovina prostaty, rakovina prsu, Kaposiho sarkom, lupenka Deriváty hematoporphyrinu jsou komerčně dodávány jako Photofrin Mářadu absorpčních píků mezi 400 a 650nm, nejčastěji používaný je při 630 nm Po aplikaci je zadržována v pokožce až 10týdnů Farmakologické využití na léčbu: rakovina plic, rakovina žaludku, rakovina děložního hrdla • dlouho byly používány jako průmyslová barviva (ale i do kopírovacích přístrojů) • nyní jsou intenzívně zkoumány hlavně kvůli jejich dobré rozpustnosti ve vodě a možnosti substituování • absorbují při 680 nm • Farmakologické využití na léčbu: rakovina trávícího traktu, kůže, prsu, plic Ftalocyaniny Absorbují při 680 nm Farmakologické využití na léčbu melanomů Naftalocyaniny Mimo jiné výborná fluorescenční značka Je specificky vychytáván mitochondriemi Rhodamin 123 Pacient přichází na kliniku s nádorem. Fotosenzibilizátor se podává injekcí. Fotosenzibilizátor se postupně koncentruje v nádoru. Fotodynamická terapie (PDT) Je jednou z možností léčby nádorového onemocnění (zejména u adjuvantní léčby), i řady nenádorových onemocnění, především kožních lézí a očních chorob. Fotosenzibilizátor je aktivován světlem a dochází k selektivní destrukci nádorové tkáně Fiber optical cable Cancerous celí (absorbs more) • / Photosensitive drug - Healthy cen I • • Cell destrucion a b C Figure 4. Cli nic al POT lase rs. (a) argon-pumped dye lase r, (b) KTP-pum ped dye lase r, (c) diode la er (courte y Cera m Opt ics, Germany). a b C Figure 5. Light Emitting Diode (LED) source for clinical POT. (a) array for skin le sio n trea t ments (courtesy EXFO Inc, Canada), (b) smalt array for intra-oral application (courtesy PRP Optoelectronic s, England), (c) interstitial linear arrays (courtesy Light Scie nces Inc., USA). TOPICALSENSITIZATION 231 (a) (b) (a) (a) (c) (b) (d)