N M R spektroskopie Metody biofyzikálni chemie - seminář (C5856) Jan Novotný novotnyj an@mail.muni.cz November 18, 2019 J. Novotný November 18, 2019 1/16 Interakce jaderného spinového momentu - kontext Doplňte k zadaným interakčním mechanismům symbolické znázornění a příslušný Hamiltonián: Dipol-dipolová interakce Chemický posun Nepřímá spin-spinová interakce /\ XX Hi = -/i.Binci OC 7/4.(7.80 ů 7/7y(3cos2y?-l) f 7 XX XX XX /-/// oc 2irJ.li.lj B0 Cl o/f Jit o e0 o'' J. Novotný November 18, 2019 2 / 16 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. J. Novotný November 18, 2019 3 / 16 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. O Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. J. Novotný November 18, 2019 3 / 16 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. Q V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí J. Novotný November 18, 2019 3 / 16 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. Q Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. O V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí O Rozlišení signálů v NMR spektru roste s velikostí externího magnetického pole, protože rezonanční frekvence je úměrná Bq. J. Novotný November 18, 2019 3 / 16 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. Q Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. O V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí O Rozlišení signálů v NMR spektru roste s velikostí externího magnetického pole, protože rezonanční frekvence je úměrná Bq. O Rezonanční signál ovlivněný pomalou výměnou vzhledem k NMR časové škále se projevuje ve spektru rozšírením a polohou rezonanční linie odpovídající váženému průměru chemických posunů limitních stavů. J. Novotný November 18, 2019 3 / 16 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. Q Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. O V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí O Rozlišení signálů v NMR spektru roste s velikostí externího magnetického pole, protože rezonanční frekvence je úměrná Bq. O Rezonanční signál ovlivněný pomalou výměnou vzhledem k NMR časové škále se projevuje ve spektru rozšírením a polohou rezonanční linie odpovídající váženému průměru chemických posunů limitních stavů. O NMR spektrum proteinu s malým stupněm strukturovanosti(foldu) se vyznačuje úzkými signály o malé disperzí. J. Novotný November 18, 2019 3 / 16 Úloha 1: Chemický posun - identifikace aminokyselin Pro daná 13 C N M R spektra určete, jaké aromatické aminokyselině náleží a proč. HO H NHj H O CH2 \ / phenylalanine iso ' i go ' iio ' 120 ' íóo 1 s'o e'o 40 20 ô PPM HO H NH2 O CH, OH tyrosine 1 éo 1 éo Uo 1 lio ' 100 s'o 1 ěí) 4b 1 šíT" PPM J. Novotný November 18, 2019 4 / 16 Úloha 2: Chemický posun - rozlišení Pro dané systémy, rozhodněte, který z dvojice označených atomů bude mít vyšší hodnotou chemického posunu: J. Novotný November 18, 2019 5 / 16 Úloha 3: J-coupling a konformace vazby, Karplusova rovnice Pro určení torzního úhlu v kovalentních strukturách slouží analýza vicinálních spin-spinových konstant (tzv. 3J-coupling). • Kvalitativní pohleď. Na základě srovnání orbitálního překryvu rozhodněte, v jaké konfiguraci nabývá 3J větší hodnoty. /=J" Hw" H • Kvantitativní pohled: K určení konformace cukr-fosfátové páteře nukleových kyselin se používá Karplusova rovnice parametrizovaná mj. pro interakci H5' a P: Jhcop = 15.3cos cp — 6.2cos(/? + 1.5. Vypočtěte hodnotu konstanty pro znázorněné konformery a charakterizujte je pomocí velikosti úhlu /3 : Úloha 3: J-coupling a konformace vazby, Karplusova rovnice Pro určení torzního úhlu v kovalentních strukturách slouží analýza vicinálních spin-spinových konstant (tzv. 3J-coupling). • Kvalitativní pohleď. Na základě srovnání orbitálního překryvu rozhodněte, v jaké konfiguraci nabývá 3J větší hodnoty. s s \/ 9 Kvantitativní pohled: K určení konformace cukr-fosfátové páteře nukleových kyselin se používá Karplusova rovnice parametrizovaná mj. pro interakci H5' a P: Jhcop = 15.3cos cp — 6.2cos(/? + 1.5. Vypočtěte hodnotu konstanty pro znázorněné konformery a charakterizujte je pomocí velikosti úhlu /3 : Úloha 3: J-coupling a konformace vazby, Karplusova rovnice Pro určení torzního úhlu v kovalentních strukturách slouží analýza vicinálních spin-spinových konstant (tzv. 3J-coupling). • Kvalitativní pohled: Na základě srovnání orbitálního překryvu rozhodněte, v jaké konfiguraci nabývá 3J větší hodnoty. Kvantitativní pohled: K určení konformace cukr-fosfátové páteře nukleových kyselin se používá Karplusova rovnice parametrizovaná mj. pro interakci H5' a P: Jhcop = 15.3cos cp — 6.2cos(/? + 1.5. Vypočtěte hodnotu konstanty pro znázorněné konformery a charakterizujte je pomocí velikosti úhlu /3 : H5" H5' cp = 180° H5" 3J - 23 Hz J. Novotný ■a ► < -š ► ■= ^<\0 November 18, 2019 6 / 16 Úloha 3: J-coupling a konformace vazby Pomocí přiloženého ID H NMR spektra odhadněte poměr a a [3 izomeru v roztoku D-glukopyranozy naměřeném v D2O. J. Novotný November 18, 2019 7 / 16 Úloha 3: J-coupling a konformace vazby Pomocí přiloženého ID H NMR spektra odhadněte poměr a a [3 izomeru v roztoku D-glukopyranozy naměřeném v D2O. Z!Í " ' ' ' To ^ 3.5 ~' 3*0 6 J. Novotný November 18, 2019 7 / 16 Úloha 4: Příklady biochemických aplikací K uvedeným problémům strukturní analýzy přiřaďte odpovídající techniku: Potlačení dipol-dipolové relaxace u proteinu Rozlišení intra- a intermolekulárních kontaktů v komplexu ligand-receptor Odstranění signálů labilních protonů v molekule nukleové kyseliny Přiřazení málo rozlišených signálů v nestrukturované části proteinu Mapování reziduí směřujících k povrchu proteinu Převedení vzorku do D2O 13C editované NOESY spektrum Exprese proteinu v deuterovaném médiu Aplikace paramagnetických sond Multidimenzionální inverzní experimenty (4D, 5D) J. Novotný November 18, 2019 8 / 16 Úloha 4: Příklady biochemických aplikací K uvedeným problémům strukturní analýzy přiřaďte odpovídající techniku: Potlačení dipol-dipolové relaxace u proteinu Rozlišení intra- a intermolekulárních kontaktů v komplexu ligand-receptor Odstranění signálů labilních protonů v molekule nukleové kyseliny Přiřazení málo rozlišených signálů v nestrukturované části proteinu Mapování reziduí směřujících k povrchu proteinu exprese proteinu v deuterovaném médiu 13 C editované NOESY spektrum převedení vzorku do D2O multidimenzionální inverzní experimenty (4D, 5D) aplikace paramagnetických sond J. Novotný November 18, 2019 8 / 16 Úloha 5: Protein vs. Nukleové kyseliny: NMR aspekty Diskutujte o následujících praktických okolností NMR experimentů při srovnání protein a DNA/RNA: Syntéza vzorku Izotopické značení Hustota 1H Sekvenční přiřazení Restrainy pro určení struktury Proteiny NA □ rS1 - = November 18, 2019 9/16 Úloha 5: Protein vs. Nukleové kyseliny: NMR aspekty Diskutujte o následujících praktických okolností NMR experimentů při srovnání protein a DNA/RNA: Proteiny NA Syntéza vzorku in vivo chemickou cestou Izotopické značení snadné nákladné Hustota 1H rel. vysoká nizsi Sekvenční přiřazení through bond J-coupling through space NOE Restrainy pro určení struktury 5: alfa vs. beta, NOE, RDC mj. NOE, RDC, J-Q -J coupling(riboza), P J. Novotný November 18, 2019 9 / 16 Úloha 6: Sekvenční přiřazení peptidu pomocí J-korelace Pomocí fiktivních výsledků (strip-plotu) 3D NMR experimentů (HNCA, určete N—»C sekvenci hypotetického peptidu: 0-1) 'a R O H\ CO \{\) -i-N — 'a R (g) (Q) N Q T J. Novotný November 18, 2019 10 / 16 Úloha 6: Sekvenční přiřazení peptidu pomocí J-korelace Pomocí fiktivních výsledků (strip-plotu) 3D NMR experimentů (HNCA, určete N—»C sekvenci hypotetického peptidu: 0-1) 'a R O H\ CO \{\) -i-N — 'a R N (o) Q J. Novotný November 18, 2019 10 / 16 Úloha 7: Časová škála interakce ligand-receptor Charakterizujte přiložená 15N-1H HSQC spektra zobrazující titrační experiment pomocí pojmů: rychlá, střední a pomalá výměna: 200 |i,M protein +100 (xM ligand (1:2) +300 |i,M ligand (3:2) +900 |i,M ligand (9:2) L0.7 L0.2 9.7 9.2 8.7 8.2 7.7 7.2 6.7 6.2 200 |i,M protein +100 (xM ligand (1:2) +300 |i,M ligand (3:2) +900 |i,M ligand (9:2) +2700 (xM ligand (27:2) J. Novotný November 18, 2019 11 / 16 Úloha 8: Populace jaderného spinu Vypočtěte rozdíl v populaci izolovaných jaderných spinu a - (3 pro atom 1H (magnetogyrická konstanta 7 = 2.68.1087~1s~1) v magnetickém poli 11.7 T a teplotě 298 K. J. Novotný November 18, 2019 12 / 16 Úloha 8: Populace jaderného spinu Vypočtěte rozdíl v populaci izolovaných jaderných spinu a - (3 pro atom 1H (magnetogyrická konstanta 7 = 2.68.1087~_1s_1) v magnetickém poli 11.7 T a teplotě 298 K. Řešení AE = Ep - Ea = huj = ^760 = e"^ = 0 999919 ^ 100000 C ~ 10000g J. Novotný November 18, 2019 12 / 16 Úloha 9: Nukleární Overhauserův efekt Uvažujme zjednodušený NOE experiment provedený na malém proteinu. Krátkým ozařováním o délce 25 ms saturujeme populaci spinu H/3 a okamžitě měříme signál blízkého spinu H7 v leucinu - za podmínky aproximace počátečního stavu (ŕ —>* 0). Ukažte, jak se za těchto podmínek zjednoduší kinetická rovnice prvního řádu popisující časový vývoj magnetizace spinu H7 v závislosti na auto-relaxaci (rychlostní konstanta p) a cross-relaxaci (a): ^ = -p[/7-/7(0)]-a[//3-//3(0)] Jaká je přibližná vzdálenost atomů H/3 a H7, jestliže jsme při tomto experimentu pozorovali změnu signálu v důsledku NOE o velikosti -0.04 a pro referenční vzdálenost atomů H/3i - H/32 1.75Ä bylo naměřeno NOE -0.3? J. Novotný November 18, 2019 13 / 16 Úloha 9: Nukleární Overhauserův efekt Uvažujme zjednodušený NOE experiment provedený na malém proteinu. Krátkým ozařováním o délce 25 ms saturujeme populaci spinu H/3 a okamžitě měříme signál blízkého spinu H7 v leucinu - za podmínky aproximace počátečního stavu (ŕ —>* 0). Ukažte, jak se za těchto podmínek zjednoduší kinetická rovnice prvního řádu popisující časový vývoj magnetizace spinu H7 v závislosti na auto-relaxaci (rychlostní konstanta p) a cross-relaxaci (a): dl. 1 dt -^[/7-/7(0)]-<7[/r-/^(0)] Jaká je přibližná vzdálenost atomů H/3 a H7, jestliže jsme při tomto experimentu pozorovali změnu signálu v důsledku NOE o velikosti -0.04 a pro referenční vzdálenost atomů H/3i - H/32 1.75Ä bylo naměřeno NOE -0.3? Řešení dl. 7 dř ř^o = -p[/7(0) - /7(0)] +