Zdeněk Moravec hugo@chemi.muni.cz 1/47 Osnova ► Základní principy IR spektroskopie ► Měřící techniky ► FT-IR transmisní měření ► ATR, DRIFT, PAS ► TG/IR, GC/IR ► Ramanova spektroskopie ► Zpracování spekter ► Analýza spekter ► Spektrální databáze ► Aplikace ► Chemie ► Restaurování uměleckých předmětů ► Biologie ► Informace o přístrojovém vybavení UCH 2/47 Molekulová spektroskopie UV-VIS IR MW 50-800 nm 1-100 lim 1-10 mm Elektronická Absorpční UV-VIS spektroskopie Luminiscenční spektroskopie Vibrační Ramanova spek- Infračervená spektroskopie troskopie spektroskopie Rotační Ramanova spek- Mikrovlnná spektroskopie troskopie spektroskopie spektroskopie ncip Penetrates Earth's Atmosphere? Radiation Type Radio Wavelenglh / m 1Q3 Microwave Infrared Visible Ultraviolet X-ray Gamma ray Iff' 10-: 0.5 kid'6 icre -o ■o -o ■2 Approximate Scale of Wavelength 111 Buildings Humans Butterflies Needle Point Protozoans Molecules Atoms Atomic Nuclei Frequency / Hz 1 104 1( 1c Temperature of objects at which this radiation is the [ peak wavelength emitted 101s 101é 1 o1 - IQ20 i I 1 1 k 10 ) k 10,0 30 k 1oo00.do0 k ■272aC -A7ZaC 9,7a&0C ■1oo00.d00fc š *0 <\ O 4/47 spektroskopie cip E s, s, L electronic energy levels vibi aiioiwl energy levels rotational energy lewis electronic transition ! Mill ill..... _ É L 1 X IR spektroskopie Princip ► NIR (0,7 - 2,5 fim; 14 000 - 4 000 cm-1) - infračervená spektroskopie v blízké oblasti ► MIR (2,5 - 25 (jtm; 4 000 - 400 cm-1) - infračervená spektroskopie ve střední oblasti ► FIR (25 - 1000 (jtm; 400 - 10 cm-1) - infračervená spektroskopie ve vzdálené oblasti IR spektroskopie Vibrace chemických vazeb ► Během vibrace vazby dochází k přechodu systému na jinou energetickou hladinu. ► Přechod mezi základní a 1. excitovanou hladinou se nazývá základní (fundamentální) vibrace . ► Pokud dochází k přechodům na vyšší hladinu, jedná se o tzv. vyšší harmonické přechody (overtony) . Jejich frekvence jsou přibližně násobkem fundamentální frekvence (energetické hladiny se postupně zhušťují). ► Pokud dojde k současné změně dvou vibračních stav molekuly jedná se o kombinační přechody . IR spektroskopie Vibrace chemických vazeb ► Valenční vibrace - dochází ke změně mezijaderné vzdálenosti ► Deformační vibrace - dochází ke změně vazebného úhlu. o=c=o-^ -^o=c=o a) b) t o=c=o o=c=Ó c) I I d) ► Vektor popisující rozložení elektrického náboje v molekule. ► Výsledný dipólmoment získame vektorovým součtem dipólmomentů jednotlivých vazeb. Absorpce infračerveného záření ► Aby mohla molekula absorbovat infračervené záření musí během vibrace docházet ke změně dipólového momentu. ► Při absorpci dochází ke změně amplitudy vibrace, frekvence zůstává nezměněna. ► Intenzita absorpčních pásu je úměrná druhé mocnině změny dipólového momentu. ► Absorpcí infračerveného záření molekulami vznikají pásová spektra. 10/47 ► Absorpční Spektrum indiga 11/47 Měřící techniky ► FT-IR - transmise, ATR ► DRIFT, IRRAS ► TG-IR, GC-IR 12/47 Měřící techniky FT-IR ►IV I "I v"V w ' X , I "I Nejbeznejsi merici technika ► Podle úpravy vzorku rozlišujeme měření v transmisním módu ATR ► Spektrometr neobsahuje monochromátor, ale interferometr ► Celé spektrum se snímá najednou, získáme interferogram, který je nutné zpracovat pomocí Fourierovy transformace A Pohyblivé zrcadlo Beam splitter 14/47 Měřící techniky Transmisní měření ► Lze měřit pevné látky, kapaliny i plyny ► Pevné látky měříme ve formě KBr tablet (1-3 hm. % v KBr) nebo jako suspenze v Nujolu ► Kapaliny měříme jako tenký film mezi okny z vhodného materiálu (KBr, KRS, NaCI, ...) Měřící techniky Transmisní měření - Nujol ► Nujol - směs alkanů s dlouhý řetězcem Měřící techniky Transmisní měření plynů ► Plyny se měří v plynových kyvetách, ty jsou konstruované tak, aby dráha paprsku byla co nejdelší ► Protože v plynném skupenství existují pouze slabé interakce mezi částicemi lze naměřit čistě rotační, rotačně-vibrační i elektronově-rotačně-vibrační spektra ■ ► 17/47 Měřící techniky ATR ► ATR - Attenuated Total Reflection ► Krystaly jsou z diamantu, ZnSe, Ge, KRS-5 (směs TIBr a Til) nebo křemíku ► Vzorek se přitlačí vysokým tlakem k měřícímu krystalu ► Paprsek se pohybuje po povrchu vzorku (0,5 - 5 /im) 90° Film Double-pass multiple internal reflection pJate L 18/47 Měřící techniky IRRAS ► IRRAS - IR Reflection Absorption Spectroscopy ► Metoda vhodná pro tenké vrstvy nanesené na kovových materiálech nebo nasorbované látky na materiálech ► Pro zvýšení citlivosti se využívá polarizovaného záření 45^ pjaitc mirror autí stípfceršťal míiTOľ (behind) 19/47 Měřící techniky DRIFTS ► DRIFTS - Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy ► Tato technika je vhodná pro měření malých částic nebo hrubých povrchů ► Využívá rozptylu IR záření ► Rozptýlené záření je pomocí kulového zrcadla odráženo na detektor ► Práškové vzorky se měří v kelímcích, pevné vzorky se obrousí abrasivem (SiC) a měří se částice zachycené na abrasivu .IR beam sample IR source detector1 20/47 Coupling TGA/IR ► TGA - termogra vi metrická analýza ► Plyny vznikající během degradace vzorku vedeme do měřící cely a pomocí IR spektroskopie stanovíme jejich složení ► Během transportu plynů z pece do měřící cely dochází k velkému zředění plynu, proto je nutné používat citlivější detektory (MCT) 21/47 0.000 0.100 0.200 0.300 ► GC - plynová chromatografie ► Méně citlivé než GC/MS, ale umožňuje analýzu stereoizomerů. ► Interferogramy je nutné snímat v krátkých časových intervalech 23/47 manová spektroskopie cip ► Komplementární metoda k infračervené spektroskopii. ► 1928 - Sir Chandrasekhara Venkata Räman objevil nepružný rozptyl záření (Ramanův rozptyl). ► Využívá silné zdroje monochromatického záření - lasery. ► Při interakci se vzorkem dochází z největší části k Rayleighovu rozptylu, energie rozptýleného záření je stejná jako energie excitujícího záření. ► S nižší pravděpodobností dochází k Ramanovu rozptylu, kdy záření část své energie předává vzorku (Stokesovy linie) nebo ji naopak vzorku odebírá (Anti-Stokesovy linie). ► Aby mohlo dojít k Ramanovu rozptylu, děj musí být spojen se změnou tenzoru polarizovatelnosti. Ramanova spektroskopie Princip Polarizovatelnost (a) popisuje deformovatelnost elektronové hustoty v okolí molekuly působením elektromagnetického záření, nebo přesněji elektrického pole generovaného fotonem. Polarizovatelnost je tensor druhého řádu, tzn. že ji lze popsat maticí 3x3. Polarizace je ovlivněna několika faktory: ► Čím více elektronů má atom, tím slaběji je k sobě váže a tím je polarizovatelnost větší. ► Čím je elektron více vzdálen od kladného jádra, tím je pohyblivější a zvyšuje polarizovatelnost atomu. ► Orientací molekuly vůči vnějšímu elektrickému poli. «xx Oíyx «zx a a a xy yy zy «xz OíyZ azz 1https://en.wikipedia.org/wiki/Polarizability http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Physical_ Properties_of_Matter/Intermolecular_Forces/Polarizability Animace - polarizovatelnost 25/47 Ramanova spektroskopie Princip Energy A Virtual energy level 1 st excited vibrational state Ground state AE1 = hv0 AE =hv V V AE =-hv e 0 Rayleigh scattering AE;=hv i "v 0 AE = -h(v0-vv) Stokes scattering AE1=hv0 AE = -h(v0+v) anti-Stokes scattering http: //commons.wikimedia.org/wiki/File:Ramanscattering.svg 26/47 Detektor 27/47 ► Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation ► He-Ne laser - 632,8 nm ► Ar laser - 488 nm, 496,5 nm a 514,4 nm ► Kr laser - 530,9 nm a 674,1 nm ► Nd:YAG laser - 1064 nm ► laserové diody ► laditelné lasery 28/47 29/47 Ramanova spektroskopie Instrumentace The Bruker FRA106 FT-Raman Accessory. The FRA 106 enables the analyst to routinely collect essentially fluorescence-free Raman data without sample preparation. Optica! diagram of the FRA 106 FT-Raman accessory and IFS 66 bench. Ramanova spektroskopie říprava vzorku ► ► ► ► ► Jednodušší než u IR spektroskopie. Pevné vzorky se měří ve skleněných kapilárách nebo jako tenké vrstvy na vhodném substrátu. Větší vzorky lze uchytit do držáku vzorku bez úpravy. Kapalné vzorky se také plní do kapilár. Pro měření plynných vzorků se využívají kyvety s násobným odrazem. Komplikací při měření bývá luminiscence vzorku. Lze ji potlačit změnou vlnové délky laseru, pokud to spektrometr umožňuje. 31/47 3500 300O 2500 " r}f>n 1SOO 1000 50 f) Ramanova spektroskopie Příprava vzorku 33/47 Ramanova spektroskopie Mikroskopy 34/47 Využití IR spektroskopie v ch emii ► ► ► ► ► ► Identifikace sloučenin srovnáním spekter s databází Kontrola čistoty připravených produktů, výhodou metody je její vysoká citlivost Kvalitativní a kvantitativní analýza polymerů, analýza degradačních produktů Monitorování polymerizačních reakcí Analýza povrchových vrstev s využitím ATR Kvantitativní analýza - Lambert-Beerův zákon: ► Kapaliny: A = ecl ► Je nutné zvolit vhodný pás - vysoký absorpční koeficient, bez překryvu s okolními pásy, symetrický a vykazující lineární závislost intenzity na koncentraci ► Plyny: A _ pel ~ RT 35/47 Využití IR spektroskopie v oblasti restaurování a konzervování uměleckých děl ► Výhodou IR spektroskopie je nízká spotřeba vzorku, příp. nedestruktivnost metody, při použití bezkontaktního spektrometru. 36/47 Využití IR spektroskopie v oblasti restaurování a konzervování uměleckých děl ► Rutinně lze provést analýzy pigmentů, pojiv, organických složek (dřevěné rámy, povrchové úpravy, a pod.) ► Mezi speciální aplikace patří např. datování dřeva, které může být pro mladší dřevěné předměty podstatně přesnější než datování pomocí 14C. ► FT-IR mikroskop se lze využít k analýze nábrusů a identifikaci složení a stratigrafie vrstev 37/47 ► Spektroskopická analýza uměleckých předmětů je velice důležitá pro konzervátory, historiky umění i sběratele. ► Ramanova spektroskopie a mikroskopie se využívá pro: ► Identifikaci anorganických pigmentů ► Identifikaci organických pigmentů ► Identifikaci pojiv a laků ► Větší předměty, např. nástěnné malby lze analyzovat s využitím optických vláken, aniž by hrozilo jejich poškození.[4] 1http://www.ndt.net/article/wcndt00/papers/idnl63/idnl63.htm Raman spectroscopic database of azo pigments and application to modern art studies Library of FT-Raman spectra of pigments, minerals, pigment media and varnishes, and supplement to existing library of Raman spectra of pigments with visible excitation 4Non-destructive analysis of museum objects by fibre-optic Raman spectroscopy 5The art of Raman 38/47 Analýza biologických vzorků ► S výhodou lze využít fluorescenční mikroskopy s Ramanovým spektrometrem. ► Na obrázku jsou buňky primátů obarvené fluorescenčním barvivem DAPI a příslušné Ramanovo spektrum. ► Pro excitaci byl využit laser o vlnové délce 532 nm. Byl získán obrázek plochy 50 x 40/im. ► Jádra buněk jsou znázorněna modře, jadérka zeleně a endoplazmatická retikula červeně. ^HEMAGAZIN, 2019, 5, 22-23 Analýza biologických vzorků ► IR spektrosokopii lze využít ke studiu biologických systémů, tzn. lipidů, proteinů, peptidů, biomembrán, nukleových kyselin, tkání, buněk, atd. ► U fosfolipidů lze stanovit konformaci řetězce a tím získat informace o uspořádání v buňce ► IR spektra proteinů obsahují výrazné absorpční pásy amidové skupiny, podle jejich vlnočtu a intenzity lze určit konformaci a sekundární strukturu (dekonvolucí a fitováním pásů) IL L. V. _ _l_I_I_I_I_I_1_ _ J_I_I_I_I_I_l_ I_|_1_ J 1700 10B0 1660 1640 1C20 - co: 40/47 Analýza biologických vzorků ► Spektra nukleových kyselin poskytují informace o konformaci hlavního řetězce kyseliny a o párovaní bází ► IR spektra lze využít i pro diagnostiku nádorů, např. sledováním závislosti polohy pásu deformační vibrace methylenové skupiny na tlaku lze odlišit zdravou a rakovinovou tkáň 147G n Q £ 4 Ě 9 10 12 14 16 19 20 Pre&sure {kbar) Spektrometry na ústavu chemie ► MIR spektrometr Bruker IFS 28 ► FT-IR ( NIR+MIR) spektrometr Bruker Equinox IFS 55/S s Ramanovým nástavcem FRA 106/S ► FT-IR ( NIR+MIR) spektrometr Bruker Tensor 27 s možností měření TG/IR ► ATR Bruker Alpha Platinum 42/47 Spektrometry na ústavu chemie MIR spektrometr Bruker IFS 28 Spektrometry na ústavu chemie Bruker Equinox IFS 55/S s Ramanovým nástavcem FRA 106/S Spektrometry na ústavu chemie Bruker Tensor 27 45/47 Spektrometry na ústavu chemie Bruker Alpha Platinum Spektrometry na ústavu chemie Mikro-ramanovský spektrometr Horiba - Labram HR Evolution - UGV ► http://ugv.cz/pracoviste-ramanovy-spektroskopie/