NMR Nukleární Magnetická Rezonance Zdeněk Moravec, hugo@chemi.muni.cz 1 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Stručná historie 1943 Nobelova cena za objev magnetického momentu protonu - Otto Stern. 1944 Nobelova cena za rezonanční metodu pro zjištění magnetických vlastností atomových jader - Isidor Isaac Rabi. 1945 První 1H NMR spektrum vody. 1952 Nobelova cena za rozvoj metod pro přesná měření jaderného magnetismu a první NMR signál - Felix Bloch a Edward Mills Purcell. 1965 Širokopásmový 1H decoupling. 1991 Nobelova cena za HR-NMR, vývoj nových pulsních technik, rozvoj FT-NMR a zavedení 2D NMR technik - Richard R. Ernst. 2002 Nobelova cena za vývoj NMR technik umožňujících určení 3D struktury biomolekul - Kurt Wütthrich. 2003 Nobelova cena za vývoj MRI - Paul C. Lauterbur. 2 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Princip Sledujeme absorpci radiofrekvenčního záření vzorkem, který je umístěn v magnetickém poli. Vzorek je nejčastěji kapalný, ale lze měřit i pevné látky a plyny. Jde o důležitou metodu v chemické a strukturní analýze. Vyžaduje silné magnetické pole, proto se nejčastěji využívá supravodivých magnetů. 3 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Jaderný spin Atomové jádro se skládá z protonů a neutronů. Obě částice mají spin ±1 2. Jaderný spin je roven součtu spinů všech nukleonů. V NMR jsou aktivní pouze jádra s nenulovým jaderným spinem. Nejčastěji se využívají jádra se spinem 1 2 , např. 1H, 13C, 19F nebo 31P. Bez vlivu vnějšího mognatického pole mají všechny orientace jaderného spinu stejnou energii. Pokud ale vložíme jádro do magnetického pole, získáme systém hladin o různých energiích. Pokud na tento systém působíme radiofrekvenčním zářením, může dojít k absorpci energie a excitaci spinu na vyšší energetickou hladinu. Poté pozorujeme návrat spinu a původní hladinu a emisi absorbované energie, kterou následně snímáme. 4 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Jaderný spin 5 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Radiofrekvenční pulsy FT-NMR využívá k excitaci jaderných spinů radiofrekvenční pulsy. Ty excitují všechna měřená jádra, např. protony, najednou. Pulsy sklápí vektor magnetizace a způsobují jeho precesi. Délka pulsů se pohybuje v řádu µs. Čím je puls delší, tím je větší i sklápěcí úhel. 6 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Chemický posun Izolovaná jádra stejného izotopu budou v magnetickém poli rezonovat při stejné frekvenci. Pokud uvažujeme molekuly, je každé jádro ovlivněno také lokálními magnetickými poli, které jsou generovány vazebnými elektrony. Tím dochází ke změně rezonanční frekvence daného jádra. Změna je dána tzv. chemickým okolím pozorovaného jádra a nazývá se chemický posun. Označuje se δ a je dán vztahem: δ = ν−νTMS ν νTMS je rezonanční frekvence standardu, ν je rezonanční frekvence signálu. Chemický posun je bezrozměrný, jelikož se jedná o velmi malé hodnoty, udává se v ppm. Chemický posun je, na rozdíl od rezonanční frekvence, nezávislý na hodnotě vnějšího magnetického pole. 7 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Interakční konstanta Pokud je v molekule více NMR aktivních jader, může docházet k jejich vzájemné interakci. Síla této interakce je dána hlavně počtem vazeb, které jádra oddělují. Velikost interakční konstanty je nezávislá na intenzitě magnetického pole. 8 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Interakční konstanta Způsob štěpení je dán počtem interagujících spinů. Pro jádra se spinem 1 2 je velikost multipletu, tzn. počet signálů po štepení a jejich vzájemná intenzita dán Pascalovým trojúhelníkem. n = 0 1 n = 1 1 1 n = 2 1 2 1 n = 3 1 3 3 1 n = 4 1 4 6 4 1 n = 5 1 5 10 10 5 1 n = 6 1 6 15 20 15 6 1 9 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Interakční konstanta Velikost interakce se vyjadřuje pomocí interakční konstanty, která se označuje písmenem J. Pro přesnější popis interakce se využívá indexů, např. interakci mezi atomy vodíku v ethanolu (přes tři vazby H-C-C-H) vyjádříme 3JHH. Její velikost se udává v Hz. 10 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Decoupling (dekaplink) Štěpením signálů spektra je důležitou informací pro strukturní analýzu, zároveň ale zhoršuje poměr signál/šum. Pro potlačení štěpení se používá tzv. decoupling, kdy kontinuálně ozařujeme dekaplovaná jádra. Tím dojde k potlačení štěpení. Ztratíme ale informaci o kvantitativním složení vzorku, protože intenzita signálu v dekaplovaném spektru není úměrná koncentraci. Gated decoupling – neozařujeme během akvizice, nedojde k potlačení NOE. Inverse-gated decoupling – ozařujeme pouze během akvizice, vhodné pro jádra se záporným gyromagnetickým poměrem – 15N, 29Si. 11 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Schéma NMR spektrometru 12 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance NMR magnety Permanentní - do 100 MHz 13 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance NMR magnety Cryogen-free - 100-300 MHz - levný provoz 14 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance NMR magnety Supravodivé magnety - nejběžnější v NMR Chlazené kapalným heliem (4-2,2 K) Magnetické pole až 23,5 T (1000 MHz) 15 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Závislost rezonanční frekvence na síle magnetického pole B0 [T] 1H [MHz] 13C [MHz] 1,41 60 15,1 2,35 100 25,15 7,05 300 75,4 11,74 500 125,7 14,09 600 150,9 16,44 700 176,05 19,97 850 213,78 22,32 950 238,94 16 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance NMR sondy Hlavní funkcí je excitace spinového systému a snímání odezvy. Obsahují lockovací kanál. Udržují stabilní teplotu vzorku. Často obsahují také gradientovou cívku(y) pro experimenty využívající pulsní gradienty magnetického pole. Podle konstrukce se dělí: Teplé sondy Kryosondy Průtočné sondy Nanosondy 17 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance NMR sondy Sondy se dále dělí podle počtu cívek. Citlivost cívek klesá se vzdálenosti od vzorku. Dvoukanálové - dvě cívky Tříkanálové (triple resonance) BB sondy mají vnitřní cívku určenou pro měření jader X a vnější pro měření 1H nebo 1H decoupling. Inverzní sondy mají uspořádání opačné a jsou vhodné pro snímání jader 1H jader, např. v 2D experimentech – 1H-13C HSQC. Sondy také dělíme sondy podle velikosti NMR kyvety, pro které jsou konstruovány, nejčastěji 5 a 10 mm. 18 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance NMR sondy 19 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Vzorky pro NMR spektroskopii Využívají se tenkostěnné skleněné kyvety, které se umisťují do plastových nebo keramických rotorků. Průměr kyvet je nejčastěji 3, 5 nebo 10 mm. Pro měření je nutné připravit roztok měřené látky v deuterovaném rozpouštědle. Signál 2H (D) se používá k lockování vzorku. Vzorky reakčních směsí se často měří v koaxiálním uspořádání, kdy se kyveta se vzorkem vloží do kyvety s deuterovaným rozpouštědlem. Signál deuterovaného rozpouštědla lze využít i jako standard ke kalibraci spektra. 20 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance 2D NMR Pro složitější molekuly už nemusí být 1D NMR spektrum čitelné. Rozlišení se dá zvýšit silnějším magnetickým polem. Lepší cestou je přechod na NMR experimenty ve dvou a více dimenzích. V dnešní době se rutinně využívá 2D a 3D NMR. 21 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance NMR v pevné fázi MAS NMR - Magic Angle Spinning. Vzorek je napěchován do keramického rotoru a rotuje pod úhlem 54,7◦ (cos2 θm = 1 3 , magický úhel). Rotace při rychlostech 0-130 kHz. Pro měření málo citlivých jader se využívá cross-polarizace. 22 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance NMR ve slabém magnetickém poli Earth’s-Field NMR. Využívá magnetické pole Země. Lze měřit velké vzorky. Pro zlepšení S/N se využívá pre-polarizace v elektromagnetu. Low-Field NMR. Systémy využívající permanentní magnety nebo elektromagnety. 23 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Využití NMR Rutinní kvalitativní a kvantativní chemická analýza. Strukturní analýza. Strukturní analýza biomolekul. Studium degradačních procesů a stupně degradace, např. barviv, polymerů, atd. Studium stupně hydratace v nástěnných malbách pomocí bezkontaktní sondy. 24 / 25 Nukleární Magnetická Rezonance Literatura 1 http://chem.ch.huji.ac.il/nmr/ 2 H. Günther (2013). NMR Spectroscopy: Basic Principles, Concepts and Applications in Chemistry, ISBN 978-3527330003 3 J. Keeler (2005). Understanding NMR Spectroscopy. ISBN 978-0-470-01786-9. 25 / 25