Editace genomu KRISTÝNA KAMARÝTOVÁ, JOZEF KOVÁČ, JANA PODIVÍNSKÁ, NORA MOHLEROVÁ, MARTINA RAJNÍKOVÁ Obsah obrázku vsedě, hrníček, stůl, zavřít Popis byl vytvořen automaticky Editace genomu je způsob, jak provádět specifické změny v DNA buňky nebo organismu. Enzym štěpí DNA na konkrétní sekvenci, a pokud je buňkou opravena, dojde ke změně nebo „úpravě“ sekvence. §Zahrnuje to štěpení na specifických sekvencích DNA enzymy zvanými „engineered nucleases“. §Vnáší se inzerce, delece nebo se stávající sekvence nahrazuje za jiné §Úpravou genomu lze změnit vlastnosti buňky nebo organismu. § Historie Obsah obrázku snímek obrazovky Popis byl vytvořen automaticky Genome editing comes of age | Nature Protocols [Internet]. [cited 2019 Dec 8]. Available from: https://www.nature.com/articles/nprot.2016.104#Fig1 Využití editace genomu § Výzkum Může být použita ke změně DNA v buňkách nebo organismech k pochopení jejich biologie a k tomu, jak fungují. § Léčba nemocí Používá se k úpravě lidských krevních buněk, které se pak vracejí zpět do těla k léčbě stavů, včetně leukémie a AIDS. Může být také použita k léčbě jiných infekcí (jako je MRSA) a genetických stavů (jako je svalová dystrofie a hemofilie). § Biotechnologie Úpravy genomu se v zemědělství používají k genetické úpravě plodin ke zlepšení jejich výnosů a odolnosti vůči chorobám a suchu nebo ke genetické úpravě skotu, který nemá rohy. VÝHODY § Řešení a poražení nemocí -Terapeutika na rakovinu -Výzkum léčiv -Vrozené nemoci § Možnost delšího a kvalitnějšího života § Růst produkce potravin a její kvalita § NEVÝHODY § Etické dilema § Bezpečnost § Ztráta diverzity populace § Pouze pro bohaté? První děti narozené s editovaným genomem § 1. summit o editaci lidského genomu konaném koncem roku 2015 ve Washingtonu - výzkum cílených zásahů do dědičné informace lidských embryí bude pokračovat a zároveň se všichni účastníci zavázali, že se nebudou pokoušet přivést na svět děti z embryí s cíleně upraveným genomem. § Konec roku 2018 - cíleným poškozením genu CCR5 se snažili dodat novou vlastnost – odolnost k viru HIV. Site-specific recombination 11_Figure02 10_Figure18 Serin/tyrosin – špecifická proteinkináza Enzymy z fágov so špecifitou na DNA -OH skupina ako nukleofil Rekombinačne rozpoznavacie miesto Serinová špecifita Tyrosinová špecifita 11_Figure06 11_Figure08 Transpozícia Transposons Jumping genes 11_Figure16 Rozdelenie transpozičných elementov table 5-03 pBAMD TRPA ME-I/ME-O FENOTYP Martínez-García et al. (2014) Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2: 46 Delécia pomocou homolognej rekombinacie FENOTYP OPAKOVANÉ POUŽITIE 10_Figure04 Delécia genov kódujuce bičík Klonovanie 500 bp pred a za oblastou na deléciu do samovražedného plazmidu pEMG Martínez-García and de Lorenzo (2012) Methods Mol Biol. 813: 267 Delécia genov kódujuce bičík Vloženie plazmidu do hostiteľskej buňky a vznik ko-integrácie Martínez-García and de Lorenzo (2012) Methods Mol Biol. 813: 267 Delécia genov kódujuce bičík Vloženie pSW-I a indukcia expresie genu I-scel Vznik DSB (double strand break) Martínez-García and de Lorenzo (2012) Methods Mol Biol. 813: 267 Výhody a nevýhody + flexibilný protokol pre rôzne aplikácie + umožnuje mnoho modifikácii v jednom klone - časová náročnosť - niektoré delécie sú ťažko dosiahnutitelné alebo až nemožné ZFNs (zinc-finger nucleases) § První generace uměle vytvořených nukleáz, předchůdce CRISPR/Cas9 systému § ZFNs = nespecifické nukleázy spojené se zinkovými prsty, syntetickými proteiny, jejichž DNA-vazebné domény umožňují rozeznávat specifické sekvence v DNA § Dvouřetězcové zlomy v DNA na předem vybraných místech (- > místně specifická mutageneze) Obsah obrázku hodiny, metr Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku hodiny Popis byl vytvořen automaticky Opravy dvouřetězcového zlomu (DSBs) způsobené specifickými endonukleázami Princip Obsah obrázku hodiny, metr Popis byl vytvořen automaticky ZFNs jsou složeny ze 2 částí: 1)DNA vázající: zinc-finger (3 bp DNA) 2)DNA štěpící: Fok I nukleáza Fok I Flavobacterium okeanokoites Restrikční endonukleáza typu IIS, tvořena N-terminální vazebnou doménou a nespecificky štěpící doménou na C-konci Výhody FokI pro její využití v GI: - vyžaduje dimerizaci – zvýší se tím specifita rozpoznání cílového místa - heterodimery - zvýšení specificity rozpoznání cílových sekvencí a eliminace možnosti vytváření nespecifického štěpení v případě homodimerů Obsah obrázku zařízení Popis byl vytvořen automaticky Výhody a nevýhody + Rychlé narušení nebo integrace do všech genomických lokusů + Vytvořené mutace jsou trvalé a dědičné + Funguje v celé řadě savčích typů somatických buněk + Úpravy vyvolané jediným transfekčním experimentem - Navržení a syntéza proteinů, které dokáží rozeznat cílovou sekvenci na bázi interakce protein-DNA je finančně i časově náročné (obtížné předvídat bez testování) - Nízká specifita a rozlišení cílené sekvence (nelze pokrýt všechny možné kombinace tripletů, avšak s vyšším počtem zinkových prstů se zvyšuje specifita) - Cílové aplikace pro ZFN § Funkční genomika / ověření cíle o Tvorba knockoutů genu ve více buněčných liniích o Kompletní knockout geny, které nejsou přístupné RNAi § Screening založený na buňkách o Vytvoření knock-in buněčných linií s promotory, fúzními značkami nebo reportéry integrovanými do endogenních genů § Optimalizace buněčné linie o Vytvoření buněčných linií, které produkují vyšší výtěžky proteinů nebo protilátek Editace genomu pomocí TALENs TALEs Tzv. transkripci aktivující efektory (Transcription Activator-like Effectors) Proteiny objeveny u gram negativních bakterií r. Xanthomonas, při infikaci rostlin Vazebná doména DNA obsahuje opakující se 33-34 AA sekvenci, 12. a 13. pozice určuje specifičnost navázání TALEs mohou vstupovat do jádra buněk , kde se váží na promotorové sekvence a aktivují transkripci rostlinných genů, napomáhají tak bakteriální infekci Připojením endonukleázy Fok I vzniká TALENs TALEs mohou být konstruovány tak, aby se vázaly na jakoukoli DNA sekvenci -> v kombinaci s nukleázou může být DNA štěpena na specifických místech Princip Fúze proteinu, obsahující vysoce specificky rozpoznávací sekvenci vázající DNA, s endonuklázou (Fok I) Fok I endonukleáza vyžaduje dimerizaci à nutná vazba dvou různých TALENs na opačných vláknech v těsné blízkosti cílové DNA Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky Základní použití programovatelných nukleáz Obsah obrázku kreslení Popis byl vytvořen automaticky Tvorba tzv. indel mutací Excize/vyříznutí specifické DNA Místně-specifická integrace Homologní rekombinace Aplikace TALENS Úprava rostlinných genomů (pšenice, rýže) – zvýšení odolnosti a vlastností plodiny Umožňuje indukci cílených změn v různých modelových organismech (škrkavka, žába, prase, krysa) Tvorba knockout kmenů a studium buněčných mutací u různých organismů (kvasinky, bakterie, krysí embryonální kmenové buňky) In vitro využíván k nápravě genetických defektů, které způsobují onemocnění (srpkovitá anémie, xeroderma pigmentosum) Výhody a nevýhody Jednodušší design oproti ZFNs Design a konstrukce TALENs za krátký čas a ve velkém množství Délka rozpoznaného cílového řetězce DNA může být delší (30-40 bp) Udává se, že oproti ZFNs produkují méně off-target mutací NEVÝHODY: - velká velikost, hůře se vnášejí a exprimují do buněk a jsou tudíž terapeuticky méně atraktivní, musí být dodávány ve virových vektorech nebo jako molekuly RNA CRISPR-CAS 9 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) CRISPR-associated protein 9 (CAS9) Objavené u baktérií, ktoré mali podobný obranný systém voči patogénom a vírusom – imunitná reakcia (baktérie vystrihnú časti vírusovej DNA, vytvoria z nej segmenty DNA, ktoré umožňujú si zapamätať ten konkrétny vírus. Pri ďalšom napadnutí týmto vírusom vytvárajú z CRISPR segmentov DNA RNA segmenty na zacielenie vírusovej DNA. Pomocou Cas9 (alebo iného enzýmu) odštiepia vrusovú DNA od seba, čím vírus deaktivujú) > Obrázok, na ktorom je reťaz Automaticky generovaný popis CRISPR-CAS 9 Obrázok, na ktorom je snímka obrazovky Automaticky generovaný popis Pre editáciu genómu potrebujeme ØCas9, čiže enzým, kt. nastrihne DNA v presnom mieste ktoré chceme modifikovať ØgRNA (guide) – vopred pripravená RNA (cca 20 bází) umiestnená do dlhšej RNA (scaffold), ktoré sa viaže na DNA. Pomocou gRNA v nej spozná Cas9 konkrétne miesto kde má prestrihnúť DNA CRISPR-CAS 9 Obrázok, na ktorom je snímka obrazovky Automaticky generovaný popis gRNA je presne dizajnovaná podľa špecifickej sekvencie DNA, ktorú chceme editovať (je zložená z RNA bází komplementárnych k cieľovej DNA sekvencii) Cas9 nasleduje gRNA, naviaže sa na cieľovú sekvenciu DNA a rozstrihne ju v oboch reťazcoch Bunka vtedy prirodzene rozpozná chybu a snaží sa ju opraviť -> prestrihnuté vlákno je dosyntetizované aj s navodenou mutáciou Využitie CRISPR-CAS9 Cielená editácia genómu ( aj u druhov, u ktorých boli tradičné techniky gen. Modifikácie neúčinné) Skúma sa jeho využitie pri liečení chorôb s genetickým základom Potenciál na úpravu genómu somatických buniek, ale teoreticky aj reprodukčných buniek Plusy a mínusy + Špecifická editácia genómu Najednoduchší, rýchly a všestranný systém Štúdium génov, možnosť génovej terapie - Možné efekty mimo cielenej sekvencie Etické obavy pri editácii reprodukčných buniek Ďakujeme za pozornosť Obrázok, na ktorom je svetlo, počítač Automaticky generovaný popis