METODY KLONOVÁNÍ Natalie Bazelová Monika Buchtová Patrícia Kittová Martina Rievajová HISTÓRIA KLONOVANIA • Október 1990 - Národný inštitút zdravia v USA oficiálne začal projekt skúmania ľudského genómu • Júl 1995 - Škótski vedci naklonovali dve ovce Megan a Morag z dvoch rôznych embryí • Február 1997 - Škótski vedci vyklonovali prvého dospelého cicavca - ovcu Dolly • Júl 1997 - Opäť škótski výskumníci vyklonovali ovcu Polly z geneticky modifikovaných kožných buniek • Júl 1998 - Havajskí vedci "vyrobili" z jednej myši 50 ďalších v troch generáciách • Apríl 1999 - Vedci z Massachusetts (USA) vyklonovali tri kozy, pričom genetickou manipuláciou zmenili zloženie ich mlieka. V mlieku sa objavil proteín, ktorý pôsobí proti srdcovému infarktu a mŕtvici • Január 2000 - Japonskí vedci vyklonovali býka. Ide o prvý prípad, kedy bol klonovaný veľký cicavec. Na klonovanie boli použité bunky z ucha kravy. • 2000 - Výskumníci z Oregonu (USA) klonovali opicu Makak Rézus. • November 2001 - V Massachusetts (USA) klonovali prvé ľudské embryá KLONOVANIE • Molekulárne klonovanie sa rozumie namnoženie úseku DNA z jednej kópie do obrovského kvanta kópií, a to prostredníctvom replikačného aparátu hostiteľskej bunky ( baktérií, kvasiniek). • Klon – súbor molekúl alebo buniek identických s pôvodnou molekulou či bunkou • Využitie – rôzne účely ako konštrukcia chimérických génov, výroba hybridizačných sond, expresia rekombinantných proteínov VYUŽITÍ KLONOVÁNÍ DNA knihovny – kolekce klonovaných DNA fragmentů genomu určitého organismu (cDNA), které jsou skladovány uvnitř hostitelských organismů (zejména bakterií) Soubor rekombinantních plazmidů nesoucích různé fragmenty představuje tzv. knihovnu genomové DNA Využití Množení lidských proteinů pomocí bakteriálních kultur; Porovnávání vývojových změn ve tkáních; Získání dostatečného množství genetického materiálu pro určení sekvence genomu VYUŽITÍ KLONOVÁNÍ Genové inženýrství Metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro → vytvářením pozměněných či nových genů Zavádění těchto genů do organizmů → pozměňování a zlepšování vlastností organizmů Zvyšování výnosů rostlin a užitkovosti hospodářských zvířat (odolnost vůči chorobám, škůdcům nebo zevním vlivům) VYUŽITÍ KLONOVÁNÍ Genové inženýrství – Potraviny a krmiva - ovlivňování agronomických vlastností Rezistence k herbicidům Rezistence k patogenům (hmyzu, virům, plísním apod.) Tolerance ke stresům (vodní stres – sucho, mráz; osmotický stres – zasolení půd) - Modifikace posklizňových vlastností Prodloužení skladovatelnosti Zpomalení zrání a navození rezistence k skládkovým chorobám - Vylepšení nutričních hodnot plodů a semen nebo rostlinných produktů využívaných průmyslově VYUŽITÍ KLONOVÁNÍ Genové inženýrství – Živočichové Zvířata (myši, drůbež, hospodářská zvířata, ryby) obsahující gen pro růstový hormon – rychlejší růst, změna vlastností produktů Přežvýkavci obsahující ve střevě GMO-mikroorganismy, které redukují toxicitu některých rostlin (rozšíření potenciálu krmiv) Drůbež s pozměněnými trávicími schopnostmi (celulóza, lignin, tuky) Drůbež se zvýšeným obsahem lysozymu ve vejcích (využití v průmyslu a farmakologii) Ovce s vylepšenou srstí Zvířata jako dárci orgánů pro transplantace VYUŽITÍ KLONOVÁNÍ Genové inženýrství Vnášení cizorodých genů nepříbuzných organismů a získávání produktů ve velkém množství (př. Příprava lidského insulinu v bakteriálních buňkách) Příprava látek s novými vlastnostmi pozměňováním stávajících nebo vytvářením nových genů (enzymy protilátky, vakcíny) Příprava látek (významné v lékařství, zemědělství a průmyslu) VYUŽITÍ KLONOVÁNÍ Genové inženýrství – Genová terapie Léčba genetických chorob dědičných i nádorových Do genomu pacienta je vložena sekvence DNA, přičemž tato sekvence kóduje nějaký chybějící nebo nefungující protein Klasické genetické choroby /vrozené vady metabolismu/: Fenylketonurie, Hemofilie A, B, Poruchy srážlivosti, Poruchy imunity, Cystická fibróza Komplexní genetické choroby Rakovina, kardiovaskulární choroby, diabetes apod. NAJČASTEJŠÍ POSTUP PRI KLONOVANÍ I.Výber vhodného klonovacieho vektoru II.Úprava koncov vektorov a koncov klonovanej DNA tak aby boli konce vzájomne kompatibilné III.Vloženie DNA do vektoru IV.Vloženie vektoru s inzertom do hostiteľských buniek V.Namnoženie hostiteľských buniek VI.Izolácia namnoženej DNA s inzertom Obrázok, na ktorom je text, mapa Automaticky generovaný popis PRENOS DNA DO BUNIEK Plazmid môže byť vložený ako do vnútra bakteriálnej, tak aj do vnútra živočíšnej bunky. Transformácia – vkladanie DNA do bakteriálnej bunky ( elektroporácia, mikroinjekcia alebo chemická cesta) Transfekcia – vkladanie DNA do živočíšnej bunky ( transfekcia fosforečnanom vápenatým, lipozómová transfekcia alebo transfekcia s využitím špeciálnych transfekčných reagentov) Transdukcia je spôsob prenosu DNA pomocou vírusov TRANSFORMÁCIA TEPELNÝM ŠOKOM ZA POUŽITIA CaCl₂ •Jedna z najčastejších foriem transformácie •u E.coli sa pripravuje: •Premytím buniek ľadovým CaCl2 •Pridaním DNA •Miernym teplotným •Krátká inkubace v růstovém médiu (zotavení bakterií, exprese selekčního markeru) cloning 6 TRANSFORMÁCIA ELEKTROPORÁCIOU •Prepláchnutie buniek vodou (odmytie elektrolytov z rastového média) •krátký elektrický puls o vysokom napätí •dočasné otvory v bunečnom obale •vstup DNA do bunky cloning7 LIPOFEKCIA •Metóda vkladania funkčného genetického materiálu do cieľových buniek s využitím katiónových lipidov •Využívanie v priemyselnej výrobe proteínov • pozitívne nabité lipidy reagujú s negatívne nabitými molekulami NK a vytvárajú celistvý komplex • ento komplex môže prechádzať cez bunkovú membránu •Takto sa dajú cieľové bunky transfekovať nie len s DNA ale aj s RNA či s proteínmi Obrázok, na ktorom je text, mapa Automaticky generovaný popis KLONOVACIE VEKTORY Podmienky pre klonovacie vektory: • musia niesť gény k vlastnej replikácií • Musia niesť klonovacie miesto tvorené radou rôznych restrikčných miest, ktoré po štiepení príslušnou restriktázou umožní inzerciu klonovaného úseku DNA do vektoru • schopnosť umožniť selekciu, ktorá rozlíši hostiteľské bunky s vloženým vektorom od buniek bez vektoru alebo bunky s vektorom obsahujúcim inzert od buniek s prázdnym vektorom • KLONOVACIE VEKTORY POZNÁME: • PLAZMIDY – čo sú malé kruhové molekuly DNA. Ku klonovanie sa používajú geneticky modifikované plazmidy. • FASMIDY – alebo tiež fagemidy, čo sú v podstate bežné bakteriálne plazmidy, ktoré nesú naviac časti genómu niektorého bakteriofága • KOSMIDY – sú to modifikované plazmidové vektory na klonovanie veľkých fragmentov DNA • BAKTERIOFÁGY – vírusy, ktoré napadajú baktérie. Pre klonovanie sú využívané ak je klonovaná väčšia molekula DNA • UMELÉ BAKTERIÁLNE A KVASINKOVÉ CHROMOZÓMY – molekuly cudzej DNA väčšie než 47 kb je možné vklonovať do umelých chromozómov PLAZMIDY AKO KLONOVACIE VEKTORY Obrázok, na ktorom je kreslenie Automaticky generovaný popis Plazmidy používané ako klonovacie vektory obsahujú: • replikátor (počiatok replikácie) • selekčný marker • klonovacie miesto • často tiež obsahujú gén LacZ, ktorý umožní tzv. modro-bielu selekciu POČIATOK REPLIKÁCIE (ori - ORIGIN OF REPLICATION) Sekvencia DNA kde sa začína replikácia Určuje vector copy number – počet vektorov v bunke Počet kópií má vplyv na stabilitu plazmidu Určuje kompatibilitu plazmidu Schopnosť 2 plazmidov koexistovať v 1 bunkovej línii Blízko príbuzné plazmidy majú tendenciu byť inkompatibilné Image result for plasmid incompatibility" Bežne využívané počiatky replikácie SELEKČNÉ MARKERY Procesy ligácie a transformácie sú málo účinné (< 1%) Selekčné markery - potvrdenie úspešného vloženia cudzej DNA do bunky Gén pre selekčný marker je vkladaný do bunky zároveň s génom záujmu Image result for selectable marker" POZITÍVNE SELEKČNÉ MARKERY Umožnenie rastu v prítomnosti toxických látok Najčastejšie – rezistencia k antibiotikám napr. ampicilín, kanamycín, gentamicín... Gén bla – kóduje enzým b-laktamázu, ktorá hydrolyzuje β-laktámové antibiotiká, napr. ampicilín INZERČNÁ INAKTIVÁCIA Úspešné začlenenie fragmentu do DNA – prejav na fenotype transformovaných baktérií Klonovacie miesto je zodpovedné za rezistenciu inzercia spôsobí stratu funkcie génu Klonovanie v plazmide pBR322 Gén pre rezistenciu k ampicilínu – vkládaná cudzorodá DNA Gén pre rezistenciu k tetracyklínu 21 MODRO-BIELY TEST Image result for blue white screening" Vektor bez inzertu Žiadny vektor Vektor s inzertom Modrá farba Biela farba Bunky nerastú Vektor obsahujúci gén pre rezistenciu k ATB a gén lacZ kódujúci β-galaktozidázu Médium obsahuje vhodné antibiotikum, IPTG (induktor expresie) a X-Gal (substrát pre β-galaktozidázu) Funkčná β-galaktozidázá Nefunkčná β-galaktozidáza Citlivé k antibiotiku KLONOVACIE MIESTO (POLYLINKER, MULTIPLE CLONING SITE) Krátky úsek DNA obsahujúci veľa jedinečných miest rozpoznávaných reštrikčnými enzýmami Reštrikčné enzýmy štiepia plazmid a umožňujú inzerciu cudzorodej DNA bez narušenia zvyšku plazmidu Image result for cloning site vector" TA KLONOVÁNÍ Využívá komplementarity mezi adeninem a tyminem Jednoduchý způsob klonování Zaklonování PCR produktů Princip: •Produkty PCR se amplifikují pouze s Taq DNA polymerázou •Většina Taq polymeráz postrádá 3‘→5‘ exonukleázovou aktivitu •S velkou pravděpodobností na 3‘ konci PCR produktu zanechává A (PCR produkt, na 3‘ konci převis jednoho A) •Využití v TA klonování: využití linearizovaného plazmidu, které nese na 5‘ konci převis T •Smíchání vektoru s insertem → rekombinantní DNA • Při TA klonování jsou zaklonovávány PCR produkty (nesoucí adeniny na svých koncích) do vektorů s převisy tyminů. ZÁKLADNÍ POSTUP PŘI TA KLONOVÁNÍ: 1. Připravíme PCR reakci s primery k cílovému úseku 2. Získaný PCR produkt ověříme elektroforetickou separací, produkt přečistíme. 3. Provedeme standardní ligační reakci. 4. Získaný plasmid se zaklonovaným PCR produktem může dále použít pro subklonování, kdy využijete restrikčních míst v MCS daného plasmidu. 5. Pro TA klonování jsou na trhu dostupné příslušné vektory, tj. s převisy T. Pro zvýšení pravděpodobnosti adeninového převisu na 3‘ konci PCR produktu je doporučováno použít primerů s guaninem 5‘ koncích. Pro TA klonování je třeba zkontrolovat, zda dostupná Taq polymeráza nemá silnou 3‘→5‘ exonukleázovou aktivitu, která by bránila tvrobě 3‘ adeninových převisů VÝHODY Není třeba použití restrikčních enzymů Jednodušší, rychlejší, levnější NEVHÝHODY Gen má 50% šanci na klonování v opačném směru RESTRIKČNÍ ENDONUKLEÁZY Štěpí esterové vazby dsDNA DNA hostitelské buňky je před účinkem vlastní endonukleázy chráněna metylací Ochrana před cizorodým genetickým materiálem V bakteriích – obrana proti bakteriofágům RESTRIKČNÍ ENDONUKLEÁZY štěpí oba řetězce dsDNA většina rozeznává palindromy rozdělují se do tříd podle: složení podjednotky polohy štěpení sekvenční specificity požadavků na kofaktor Image result for palindromic sequence restriction enzyme" II TŘÍDA Štěpí v místě nebo blízko vazebného místa Není nutná hydrolýza ATP, ale přítomnost Mg2+ Velikost - do 30 kDa Rozpoznávají palindromické sekvence o 4-8 bp Lepivé nebo tupé konce Image result for examples of restriction endonuclease type 2" GATEWAY KLONOVÁNÍ Firma Invitrogen (1990) Přenos DNA sekvencí do vektorů pro funkční analýzu a proteinovou expresi GATEWAY KLONOVÁNÍ Zachovává orientaci a čtecí rámec Rychlý a efektivní (95 %) přenos DNA sekvencí do vektorů Restrikční fragmenty, PCR produkty, cDNA klony Přenos velkého množství DNA sekvencí do mnoha vektorů Reverzibilní rekombinace PRINCIP GATEWAY KLONOVÁNÍ Integrace bakteriofágu do bakteriálního genomu Tvorba nových rekombinantních míst – attL a att R Vystřižení bakteriofága – obnova attP a att B BP REAKCE Inzert obsahuje attB sekvenci Donor obsahuje attP sekvenci Tvorba Entry klonu – obsahuje DNA zájmu ohraničenou attL sekvencí Vedlejší produkt Gateway BP and LR reactions TVORBA ENTRY KLONŮ Rekombinace PCR produktu nebo plazmidu s donorním vektorem TVORBA ENTRY KLONŮ TOPO klonování Na PCR produktu krátká komplementární sekvence TVORBA ENTRY KLONŮ Restrikční klonování Restrikční endonukleázy Lepivé konce Restriction cloning LR REAKCE Entry klon obsahuje attL sekvenci Cílový vektor obsahuje attR sekvenci Tvorba expresního klonu s DNA zájmu ohraničenou attB sekvencí Vedlejší produkt – toxický Není nutná selekce Děkujeme za pozornost!