Metódy štúdia proteínových interakcií Vanda Hošeková, Dagmar Pekárková, Štěpán Onderka, Timotej Gajdošík, Miroslav Herczeg 1 Povrchová plazmonová rezonancia (SPR) •Rezonančná oscilácia elektrónov na rozhraní materiálov s rozdielnou optickou hustotou •Imobilizácia makromolekuly na povrchovú vrstvu kovu •Druhá interagujúca molekula privádzaná úzkou kapilárou •Ožiarenie monochromatickou vlnou, spĺňajúcou podmienky rezonancie •„Úplný odraz“, prostredie s vyšším indexom lomu nižší index lomu •Vznik plazmonovej vlny (oscilácia elektrónov) a jej meranie •Naviazanie a zmena tvaru makromolekuly mení index lomu zmena signálu •Možnosť zistiť nielen disociačnú konštantu ale aj kinetické konšt. vzniku a rozpadu komplexu 2 • 3 Dynamický rozptyl svetla (DLS) •Charakteristika veľkosti a tvaru makromolekúl •Ožiarenie vzorky monochromatickým svetlom •Po dopade na malé častice sa svetlo rozptyľuje do všetkých smerov (Rayleigho rozptyl) pričom pri kontinuálnom snímaní je možné stanoviť Brownov pohyb danej molekuly, ktorý definuje jej veľkosť •Malé častice, rýchly pohyb Veľké častice, pomalý pohyb •Difúzny koeficient častíc •Monodisperzia/polydisperzia •Hydrodynamický polomer 4 Obrázok, na ktorom je hodiny Automaticky generovaný popis 5 Försterov rezonančný prenos energie (FRET) Obrázok, na ktorom je text, mapa Automaticky generovaný popis •Výmena energie medzi dvomi svetlo-citlivými molekulami •Donorová molekula v exc. stave odovzdá energiu akceptorovej cez dipól-dipól interakciu, dôležitá je vzdialenosť •Detekcie rôznych interakcií, medzi proteínmi, medzi doménami proteínov •Možnosť aplikácie in vivo • Obrázok, na ktorom je hodiny Automaticky generovaný popis 6 Koimunoprecipitácia (Co-IP) •častá technika na štúdium špecifických proteínov a ich interakčných partnerov vo vzorkách buniek alebo tkanív –najmä na identifikáciu nových protein-proteínových interakcíí a ich validáciu •fyziologicky relevatná metóda nepriamej identifikácie protein-proteínových interakcií •využíva proteín-špecifické protilátky na vychytávanie proteínov viazaných v komplexe s inými proteínmi (často neznámymi) –Bait <-> pray protein 7 Priebeh koimunoprecipitácie •tvorba bunkových lyzátov pomocou nedenaturačných činidel •použitie špecifickej protilátky •naviazanie antigénu zo vzorky na protilátku •precipitácia a premytie antigénu a na ňom naviazaných proteínov –precipitácia pomocou agarózových/ magnetických guličiek •vymytie a analýza proteínov naviazaných na antigén 8 https://www.mybiosource.com/learn/assay-learning-center/coimmunoprecipitation/ Imunoprecipitácia vs. Koimunoprecipitácia 9 Imunoprecipitácia – cieľom metódy je získať primárny cieľ => antigén Koimuprecipitácia – cieľom metódy je získat sekundárny cieľ => proteíny interagujúce s antigénom https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-cente r/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/co-immunoprecipitation-co-ip.html Výhody vs. Nevýhody •vysoko špecifická a veľmi jednoduchá metóda •podmienky podobné fyziologickým –prevedenie metódy, konformácia získaného proteínového komplexu •identifikácia proteínov vyskytujúcich sa v bunke vo veľmi malom množstve •získaný komplex je pripravený na analýzu ďalšími metódami –WB, MS •slabé signály z nízko-afinitných proteínov •nevhodné pre rýchle proteínové reakcie •náročná izolácia veľmi afinitných protilátok •nutnosť výberu správnej vysoko-špecifickej protilátky • 10 Iné typy imunoprecipitácie •RNP imunoprecipitácia –izolácia miRNA z RNP komplexov •Chromatínová imunoprecipitácia (CHIP) –identifikácie interakcie proteínu a DNA v bunke –asociácia génového regiónu s určitým proteínom –určovanie väzby transkripčných faktorov 11 ýsledok vyhľadávania obrázkov pre dopyt CHIP immunoprecipitation https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chromatin-immunoprecipitation-chi p.html ýsledok vyhľadávania obrázkov pre dopyt RNP immunoprecipitation Pull-down assay •In vitro afinitní purifikační metoda •Podobná koimunoprecipitaci •Záchyt proteinových komplexů na povrch matrice prostřednictvím interakce krátké fúzované sekvence nebo vazbou (tzv. afinitní značky, se specifickým ligandem imobilizovaným na povrchu matrice) •Pro studium proteinových interakcí je vyžadováno klonování a přenos cizorodé rekombinantní molekuly DNA do buněk za účelem exprese proteinu fúzovaného s afinitní značkou •Výhodou je možnost identifikovat i interakční partnery různých nízkomolekulárních ligandů (např. kofaktorů) 12 Průběh •Imobilizace afinitního systému (ligand) specifického • pro afinitní značku (tag) na pevný nosič •Exprese rekombinantních fúzně značených • proteinů nebo vazba afinitní značky na protein • (tzv. návnada) àimobilizace na afinitní systém •Inkubace se zdrojem interakčních partnerů • (tzv. kořist) •Promývání a eluce •Analýza • • • • • 13 Systémy afinitních značek a jejich partnerů 14 https://www.linkos.cz/files/klinicka-onkologie/395/4488.pdf GST systém •Glutathion S-transferáza (211 aminokyselin, 26kDa) •DNA sekvence integrovaná do expresních vektorů pro produkci rekombinantního proteinu •GST protein fúzován k N-konci rekombinantního proteinu •Výsledek: GST- značený fúzní protein •Vazba enzymu se substrátem glutathionem (GSH) •Redukovaný GSH na pevném nosiči (skrz sulfhydrylovou skupinu) 15 https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-cente r/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/gst-tagged-proteins-production-purificati on.html 16 His-tag systém •6-10 histidinových zbytků •DNA sekvence integrovaná do expresních vektorů pro produkci rekombinantního proteinu •Fúzováno k N- nebo C- konci rekombinantního proteinu •Výsledek: fúzovaný protein s 6xHis nebo poly-His-tagem •Vazba His-řetězce k imobilizovaným kovovým iontům (Ni2+ , Co2+ , Cu2+) •Imobilizace iontů chelatačním činidlem (NTA, IDA) • 17 18 https://www.researchgate.net/figure/Immobilization-of-His-tagged-protein-on-Ni-2-NTA-surface-A-line ar-sequence-of-6-12_fig1_44626558v Biotinový systém •Biotin (vitamín H) je malá molekula v bočním řetězci s kys. valerovou •Její karboxylová skupina může být chemicky modifikovaná •Různé reaktivní skupiny cílí proteinové části (-NH2, -SH) •Imobilizace na avidin •Vzniká extrémně silná interakce biotin-avidin •Pro eluci jsou nutné drsné podmínky způsobující denaturaci •Komerční dostupnost alternativních činidel pro značení biotinem, modifikované avidinové pevné nosiče • 19 https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-cente r/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/avidin-biotin-interaction.html Proximity ligation assay (PLA) •Detekcia proteínov, proteínových interakcii, translačných modifikácii proteínov •Väzba dvojice sond – špecifické protilátky s naviazanými oligonukleotidmi na proteín/komplex proteínov •In vitro – Solution phase PLA, Solid phase PLA • In situ – skúmanie endogénnych proteínov v tkanivách, bunečných kultúr • • • 20 https://www.linkos.cz/files/klinicka-onkologie/395/4492.pdfc Solution phase - v kvapalnej fáze 1.Pridanie sond ku vzorku 2.Pridanie spájacieho oligonukleotidu a DNA ligázy 3.Amplifikácia a detekcia – qPCR • •Nenáročná metóda – veľký počet vzoriek •Vysoká citlivosť - femtomóly • 21 https://www.linkos.cz/files/klinicka-onkologie/395/4492.pdf Solid phase – na pevnej fáze •Podobnosť ELISA •Naviazanie proteínu na protilátku uchytenú na pevnej vrstve •Nasledovné pridanie sond, amplifikácia & detekcia ako v kvapalnej fáze • 22 https://www.linkos.cz/files/klinicka-onkologie/395/4492.pdf In situ •Interakcia proteín-proteín •Interakcia proteín-modifikovaný proteín •Využitie sekundárnych sond •Rolling circle amplification (RCA) – syntéza cDNA •Phi29 DNA polymeráza •Produkt amplifikácie zostáva naviazaný na cieľový proteín •Detekcia pomocou hybridizácie s fluorescenčne značnými oligonukleotidmi 23 https://www.linkos.cz/files/klinicka-onkologie/395/4492.pdf •Pokročilá analýza, možnosti sledovania viacerých analytov •Citlivá – schopnosť sledovania jednotlivých molekúl •Prirodzené prostredie, špecifický signál ľahko rozlíšiteľný od nešpecifického •Molekulárna onkológia, diagnostika, farmakológia ü • vNedá sa využiť in vivo vNie je možné identifikovať nové proteíny v https://www.youtube.com/watch?v=RFTbb5xd6iQ https://bitesizebio.com/22920/proximity-ligation-assay-pla-for-dummies/ https://bitesizebio.com/22920/proximity-ligation-assay-pla-for-dummies/ 24 Izotermálna titračná kalorimetria (ITC) 25 •Kvantitatívna analýza proteínových interakcii •Bez značkovania •Zistenie všetkých parametrov interakcie •V natívnom stave •Zistenie väzobnej afinity (KD), reakčnej stechiometrie (n), reakčnej entalpie (∆H) • https://www.malvernpanalytical.com/en/products/technology/microcalorimetry/isothermal-titration-cal orimetry/ https://www.researchgate.net/figure/Basic-principle-of-isothermal-titration-calorimetry-Schematic-r epresentation-of-the_fig4_282834104 26 •Referenčná cela – voda (pufor) •Vzorková cela – proteín 1.Pridanie ligandu striekačkou 2.Zaznamenanie zmeny teploty (exotermická x endotermická reakcia) 3.Reakcia detektoru - mikrokalorimetru (zníženie x zvýšenie prívodu tepla) • https://www.malvernpanalytical.com/en/products/technology/microcalorimetry/isothermal-titration-cal orimetry/ 27 -Afinita merateľná v rozmedzí KA 103 až 109. ( KA = 1/KD), smernica vyznačeného úseku -Stechiometria – kolmica na osu X z bodu inflexie -Entalpia – rozdiel počiatočného a konečného energetického stavu -Následné dopočítanie ∆G, ∆S -∆G= ∆H - T∆S -∆ G0 = -RTln Ka - https://www.researchgate.net/figure/Basic-principle-of-isothermal-titration-calorimetry-Schematic-r epresentation-of-the_fig4_282834104 28 •Metóda merania termodynamických vlastností proteín-proteínovej interakcie •Zisťovanie stechiometrie, enzýmovej kinetiky, špecificity •Popisovanie mechanizmu interakcie •Bez nutnosti značenia • • vVysoká spotreba vzorku vCitlivosť na bubliny, agregáciu • https://www.malvernpanalytical.com/en/products/technology/microcalorimetry/isothermal-titration-cal orimetry/ 29 Proteinové čipy •Vysoce výkonná in-vitro metoda •Mnoho způsobů detekce, značené i neznačené metody •Detekce proteinu, posttranslační modifikace, identifikace interakcí a ligandových receptorů •Podobná DNA čipům https://en.wikipedia.org/wiki/Protein_microarray#/media/File:Protein_arrays.svg •http://nappaproteinarray.org/image/NAPPA_slides.jpg Související obrázek •Ohromné množství kombinací testováno zároveň •Teoreticky i celý proteom buňky testovaný zároveň • •Nutnost navázat proteiny na matrici •Velmi složité •Velmi drahé •