C7188  Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Moderní  metodické  přístupy     v  molekulární  medicíně  II       GENOMIKA  II   Ondřej  Slabý,  Ph.D.   Masarykův  onkologický  ústav   Univerzitní  centrum  buněčné  imunoterapie   Lékařská  fakulta  Masarykovy  univerzity   ©  Ondřej  Slabý,  2011   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana  2   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana  4   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Analýza  obrazu     Odečtení  pozadí  od  „foreground“   –  background  substrac;on     (griding,local  background,  median,  empty  spot,…)   SNR  –  „signal-­‐to-­‐noise  ra;o“,  odstup  intenzity  popředí   od  šumu  pozadí     -­‐převod  obrazové  informace  na  numerická  data   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana  4   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana  3   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  4   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Gene  Expression  Arrays:    ScaSer  Plot   5   7   9   11   13   15   Untreated  (log2  raHo)        Treated   (log2  raHo)     5   7   9   11   13   15   Two  fold  line   Linear  Best     Fit  Line   ~9.5   ~5.5   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana  4   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Normalizace  dat   ukázky  normalizačních  metod   Základem  většiny  normalizačních  metod  je  předpoklad,     že  počet  genů  se  změněnou  mírou  exprese  je  výrazně     nižší  než  těch,  jejichž  exprese  se  nemění.     -­‐minimalizace  vlivu  „nebiologických“  zdrojů  variability   -­‐kompenzace  nelinearity  dat  mezi  jednotlivými  čipy     a  uvnitř  daného  čipu   PoziHvní  kontroly:   Referenční  geny  s  „konstantní“  expresí  ve  tkáních     kontrolní  geneHcký  materiál  (referenční  vzorek)   kontroly  účinnosH  hybridizace  –  artreficiální  sekvence     NegaHvní  kontrola:   -­‐pozadí  hybridizace   -­‐Affymetrix  -­‐  mutace  v  jednom     nukleoHdu  sondy     ! Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana  5   ©  Ondřej  Slabý,  2009   7   Normalizace  dat  Cy3  a  Cy5     vybalancování  rozdílného  signálu  ze   značení  Cy3  a  Cy5     Jeho  nerovnoměrnost  může  být   způsobena:   -­‐rozdílnou  inkorporací  barviva  do  NK   -­‐rozdílným  množstvím  mRNA   -­‐odlišnými  parametry  při  skenování     0 200 400 600 800 1000 1200 cy3 cy5 Log  of  IntensiHes   Number  of  clones   0 200 400 600 800 1000 1200 1400 cy3 cy5 ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  6   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Normalizace  Lowess:  princip   Loess  (or  lowess)  :  Locally  WEighted  Scaqerplot  Smoothing  (vyhlazování)   Normalizace  závislá  na  intezitě  signálu   Místní  lineární  regrese   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  7   StaZsZcká  analýza  dat   Základní  dělení  metod  je  na  „unsupervised“  (využívají  jako  vstup  pouze  naměřené   hodnoty  bez  informací  o  vzorcích,  klastrovací  metody)  a  „supervised“  (využívají  i  další   známé  informace  o  vzorcích,  idenHfikace  biologicky  významných  genů,  klasifikační   metody)   Další  skupina  metod  propojuje  informaci  o  genové  expresi  s  dostupnými  informacemi   o  biologické  funkci  genů  (analýzy  signálních  drah,  informace  z  databáze  GO  „gene   ontology“,  a  další)   1)  IdenZfikace  biologicky  významných  genů   -­‐geny  s  reprodukovatelnou  signifikantně  rozdílnou  expresí     mezi  jednotlivými  podmínkami  experimentu   -­‐poměr  exprese  v  jednotlivých  experimentech  (fold  change)   -­‐t-­‐test  (test  rozdílnosH  průměrů  exprese  v  jednotlivých     skupinách)   -­‐neparametrické  testy  (Mann-­‐Whitney,  Wilcoxon  test)   -­‐Significance  Analysis  of  Microarrays  (SAM)   -­‐MulHfaktoriální  ANOVA  (nejsignifikantnější  geny     pro  dané  skupiny)   Hranice  významnosH  (1%  =  1  ze  100,  u  čipu  je  to  200  falešně  poziHvních  z  20000,   Bonferoniho  korekce)   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  8   Shlukova  analýza  je  jednou  z  nejpoužívanějších     vícerozměrných  staHsHckých  metod     Jedna  se  o  exploraHvni  techniku,  ktera  se  použivá  zejmena     v  případech,  kdy  nemame  žadne  a  priori  znalosD  o  struktuře     uvnitř  dat.     každý gen je reprezentován vektorem jehož souřadnice, jsou hodnoty exprese genu v jednotlivých experimentech (v jednotlivých vzorcích), vzdálenost je měřena mezi vektory.   Ukolem  shlukovacích  metod  je  tedy  najit  v  datech  skupiny  prvků  (shluky)  tak,  že  prvky   jednotlivých  skupin  budou  v  jistem  smyslu  více  podobné  než  prvky  z  jiných  skupin,  tzn.   nalezené  skupiny  prvků  budou  co  nejvíce  homogenní   Snažíme  se  nalézt  mezi  zkoumanými  geny  (resp.  biologickými  vzorky)  skupinky  genů   (resp.  biologických  vzorků),  ktere  vykazují  za  specifických  podminek  nebo  u  daného   fenotypu,  podobné  chování.   2)  Ukázky  mulZdemenzionálních  metod  analýzy  čipových  dat   Shlukovací  analýzy   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana    9   ©  Ondřej  Slabý,  2009   52 41 3 Hierarchické klastrování 3 1 4 2 5 Vzdálenost  mezi  jednotlivými  klastry   Dendrogram   Podobnost  je  vyjádřena  hierarchickým  stromem  –   dendrogram  s  teplotní  mapou  „heat-­‐map“   Heat  map   -­‐kalkulace  vzdálenosH  mezi  všemi  geny  a  nalezení  nejmenší.     K  ní  se  seskupí  všechny  jí  podobné  a  vytvoří  se  klastr.   -­‐po  vytvoření  X  počtu  clusterů  se  hledají  vzdálenosH  mezi   klastry  (hierarchical  clustering)   -­‐počet  klastrů  není  omezen   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana    17   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Klastrová  analýza  u  karcinomu  prsu   Sorlie  et  al,  2002,  PNAS   Úvod  do  molekulární  medicíny  3/12   Strana    17   ©  Ondřej  Slabý,  2009   ER -/+ -/+ -/+ +/++ ++ +++ HER2 - +++ - / + - / + - - / + p53mut 82% 71% 33% 80% 40% 13% CK 5/6, 17 +++ +/- +++ - - CK 8/18 - - + +/++ +/++ +++ c-myb / ost. +++ +++ -/+ +++ - - Sorlie  et  al,  2002,  PNAS   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana    13   ©  Ondřej  Slabý,  2009   3)  Klasifikační  metody   Jejich  podstatou  je  znalost  informace  o  charakteru  vzorku  tzn.  supervised  přístup.   Principem  klasifikačních  metod  v  analýze  dat  z  DNA  čipů  je  vytvoření  rozhodovacího   pravidla,  ktere  by  na  zakladě  naměřených  hodnot  genové  exprese  umožňovalo  přiřazení     pacienta  do  jedne  z  předem  definovaných  tříd  (například  zdravý,  nemocný).  Z  toho  je   zřejmé,  že  by  se  „dobré“  rozhodovací  pravidlo  založené  na  expresních  datech  mohlo   zařadit  po  bok  stavajících  diagnosHckých  metod  a  výrazně  tak  přispět  ke  zpřesnění   diagnosHky  závažných  onemocnění  (klasifikační  stromy,  Support  Vector  Machines   (SVM),  metoda  k-­‐nejbližších  sousedů,..)   MOLEKULÁRNÍ  KLASIFIKACE  NÁDORŮ:   precizní  klasifikace  je  základem  léčebného     úspěchu,  současné  metody  jsou  založeny     na  morfologii,  imunohistochemii,  geneHce     a  klinické  odpovědi   řada  diagnosHckých  nejasnos~  (heterogenita)   ČIPY:   -­‐idenHfikace  nových  jednotek  na  podkladě     profilu  genové  exprese   -­‐reklasifikace  stávajících  jednotek   -­‐idenHfikace  skupin  či  jednotlivých  genů     „markerů“  specifických  pro  dané  jednotky   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana    19   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Predikce  metastaZckého  potenciálu  u  pacientek     s  časnými  stádii  mamárního  karcinomu   Van’t  Veer  et  al.  (Nature,  2002)   AGENDIA   96  sporadických  mamárních  karcinomů   46  pacientek  se  špatnou   prognózou  (do  5  let   se  nevyvinuly  vzdálené   metastáze)   50  pacientek  s  dobrou   prognózou  (do  5  let   se  nevyvinuly  vzdálené   metastáze)   Sada  70  genů  -­‐  patent   5852  genů  se  signifikantním     rozdílem  v  expresi  mezi  skupinami     70  genů  nejvíce  korelujících  s  klinickým   stavem  použila  pro  klasifikaci   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana    20   ©  Ondřej  Slabý,  2009   PROTOKOL  KLINICKÉ  STUDIE  „MINDACT“   (Microarray  In  Node  negaHve  Disease  may  Avoid  ChemoTherapy)     Pacientky  s  karcinomem  prsu:  T1-­‐3N0M0   Registrace  do  studie,  rebiopsie    tumoru  a  odesláním  vzorku  naHvní   tkáně  do  centra  studie   Stanovení  prognózy  pacientek  (riziko  relapsu  choroby):   1.  “randomizace“  pacienta   1.  klinicko-­‐patologický  prognosHcký  systém  (Adjuvant  OnLine)   2.  70-­‐genový  prognosHcký  profil  genové  exprese  tumoru   Oba  prognosHcké  systémy   vyhodnoHly  vysoké  riziko   časného  relapsu  choroby   Oba  prognosHcké  systémy   vyhodnoHly  nízké  riziko  časného   relapsu  choroby   Výsledky  obou  prognosHckých   systémů  jsou  ve  vzájemném   rozporu   3.  randomizace  pacienta   Chemoterapie:   A)  s  antracyklinem   B)  s  kapecitabinem/docetaxelem   2.  randomizace  pacienta   Chemoterapie:      NE                                                      AN0   Hormonoterapie          NE:  ER-­‐                                                                                                                                                          ANO:  ER+       EORTC  Protocol  10041  –  BIG  3-­‐04  -­‐  hqp://www.eortc.be/services/unit/mindact)     Rozpočet  ~  20  mil.  EUR     Pořádá  síť   TRANSBIG   40  insHtucí  21  zemí     Zařazení  5000  pacientek   v  prvních  3  letech   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana    21   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Moderní  metodické  přístupy  v  molekulární  medicíně  II  –  proteomika  (dvojrozměrná   elektroforéza,  hmotnostní  spektrometrie,  proteinové  čipy),  využi~  proteomiky   v  diagnosHce  nádorových  onemocnění   Molekulární  epidemiologie  –  definice  a  vymezení  oboru,  idenHfikace  molekulárních   rizikových  faktorů  vzniku  a  rozvoje  onemocnění,  analýza  vztahu  molekulárních  faktorů  a   vlivů  prostředí  na  rozvoj  nádorového  onemocnění,  význam  molekulární  epidemiologie  u   karcinomu  plic  a  kolorektálního  karcinomu     Náplň  příšk  přednášky   Take  home   Analýza  čipových  dat  –  pozadí,  normalizace     Analýza  čipových  dat  -­‐  idenHfikace  biologicky  významných  genů   Analýza  čipových  dat  -­‐ukázky  mulHdemenzionálních  metod  analýzy  čipových  dat  -­‐  Shlukovací  analýzy     Analýza  čipových  dat  –  klasifikační  metody   Molekulární  klasifikace  nádorových  onemocnění  –  ukázky   Aplikace  čipových  technologií  do  klinické  praxe  –  studie  MINDACT,  Agendia,  Roche  AmpliChip  CYP450   mikroRNA:  nová  úroveň  regulace  genové  exprese  –  biogeneze  a  biologická  funkce   mikroRNA  v  patogeneze  nádorových  onemocnění   mikroRNA  jako  biomarkery  (SNP,  tkáňové,  sérové)   mikroRNA  jako  terapeuHcké  cíle   mikroRNA  čipy           Strana    38   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12   Strana    39   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Dotazy?   Úvod  do  molekulární  medicíny  4/12