C7188  Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Moderní  metodické  přístupy     v  molekulární  medicíně  III       GENOMIKA  III,  PROTEOMIKA   Ondřej  Slabý,  Ph.D.   Masarykův  onkologický  ústav   CEITEC   Lékařská  fakulta  Masarykovy  univerzity   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    2   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana  3   ©  Ondřej  Slabý,  2009   •  Současná hybridizace dvou vzorků DNA značených odlišnými fluorochromy na normální metafázní chromozomy fixované na podložním skle –  DNA pacienta (nádorová) značena zeleně (FITC) –  kontrolní DNA (DNA zdravého jedince) značena červeně (TRITC) Nelze detekovat balancované translokace a inverze, obecně změny při nichž nedochází ke kvantitativní změnám     KomparaSvní  genomová  hybridizace  (CGH)   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana  4   ©  Ondřej  Slabý,  2009  ©  Ondřej  Slabý,  2009   Princip  chromozomové  CGH   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana  5   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Výsledek  chromozomové  CGH   •  vizualizován  pomocí  fluorescenčního  mikroskopu   •  pro  každý  fluorochrom  je  obraz  snímán  kamerou  do  počítače   •  speciální  soLwarový  program  změří  intenzitu  obou  fluorochromů  podél   každého  chromozomu   •  výsledkem  analýzy:  CGH  profil  -­‐  poměr  intenzit  signálů  obou  fluorochromů   –  poměr  1  =  nedošlo  k  žádné  kvan[ta[vní  změně       –  poměr  <0,75  =  delece   –  poměr  >1,25  =  duplikace,  amplifikace   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana  6   ©  Ondřej  Slabý,  2009   6   Genomová  array  CGH  (aCGH)   Minulost  –  cDNA  arrays  for  CGH   Původ  genomových  sekvencí  DNA  pro  aCGH   YAC  [Yeast  Ar[ficial  Chromosomes]  (0,2-­‐2  Mb)   BAC  [Bacterial  Ar[fial  Chromosomes]  (300  kb)     PAC  [P1-­‐derived  Ar[ficial  chromosomes]  (130-­‐150  kb)   plazmidů  (30-­‐45  kb)   Současnost  –  oligonukleoSdové  arrays  CGH    (oaCGH)   Rozlišovací  schopnost  array-­‐CGH  závisí   právě    na  typu  použitého  vektoru,     V  každém  případě  je  však  řádově  vyšší     než  u  chromozomové  CGH!!!   Sling  arrays  –  překrývající  se  próby,  10  bp   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  7   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Genomová  array  CGH  (aCGH)   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  8   kolorektální  karcinom   Karcinom  hrdla  děložního     CGH    v  onkologii   20  primárních  tumorů   20  primárních  tumorů   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana  9   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    10   ©  Ondřej  Slabý,  2009    Za  gene[cky  polymorfní  je  považován  znak  s  nejméně  dvěma  gene[cky   podmíněnými  variantami  v  jedné  populaci,  které  se  nachází  v  takových   frekvencích,  že  i  zřídkavá  má  frekvenci  alespoň  1%.     SNP  =  single  nucleo[de  polymorphism,  jsou  jednonukleo[dové  polymorfní  znaky   Celogenomové  mapy  SNPs  jsou  dostupné  ve  webových  databázích  (~6  milionů)     Mezi  lidmi  je  přibližně  99,9%  shoda  v  sekvenci  DNA   Zbývajících  0,1%  nás  činí  jedinečnými  (jak  vypadáme,  nemoci,  kterými  budeme   trpět,  …)     Přibližně  1  SNP  per  1.000  bp     90%  genů  obsahuje  alespoň  1  SNP     SNP  čipy   Affymterix  SNP  čipy   Mapping  10K    array  =>  Mapping  100K  array  =>  Genome-­‐wide  Human  SNP  array  5.0   (500K)  =>  Genome-­‐wide  Human  SNP  array  6.0  (1.8  million,  SNP,  CNV)   Umožňuje:   Detekci  SNP   Počet  kopií  daného  genu     (amplifikace,  delece,  aneupoildie)   Ztráta  heterozygotnosI   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    11   Affymterix  SNP  čipy   •  HJ  dané  alely:    AA,  AB,  BB   •  Intenzita  signálu:   počet  kopií   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    12   Pro  každou  alelu   5  sond     +     5  párových  sond   s  nukleoIdovou  záměnou   (např.  v  pozici  -­‐4)   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  13   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   ©  Ondřej  Slabý,  2009  Strana  14   ©  Ondřej  Slabý,  2009   ChIP-­‐on-­‐chip  technologie   kombinace  chromaSnové  imunoprecipitace  a  čipové  technologie   Discover  protein/DNA  interacSons!!   Např.  Agilent  Technologies…   To  answer:   which  genes  are   regulated  by  a   known  TF/DNA   binding  protein   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    15   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Technologie  čipů  k  detekci  methylace  CpG  oblasd   Např.  Agilent  Technologies…   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    16   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    17   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Technologie  exonových  čipů   Umožňuje  detekci,  i  nových,  sestřihových  variant  známých  genů   Affymetrix  GeneChip®  Human  Exon  1.0  ST  Array   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    18   ©  Ondřej  Slabý,  2009   biome,  cellomics,  chronomics,  clinomics,  complexome,  crystallomics,  cytomics,  cytoskeleton,   degradomics,  diagnomicsTM,  enzymome,    epigenome,  expressome,  fluxome,  foldome,  secretome,   functome,  functomics,  genomics,  glycomics,  immunome,  transcriptomics,  integromics,  interactome,   kinome,  ligandomics,  lipoproteomics,  localizome,  phenomics,  metabolome,   pharmacometabonomics,  methylome,  microbiome,  morphome,  neurogenomics,  nucleome,   secretome,  oncogenomics,  operome,  transcriptomics,    ORFeome,  parasitome,  pathome,   pep[dome,  pharmacogenome,  pharmacomethylomics,  phenomics,  phylome,  physiogenomics,   postgenomics,  predictome,  promoterome,  proteomics,  pseudogenome,  secretome,  regulome,   resistome,  RNome,  ribonome,  ribonomics,  riboproteomics,  saccharomics,  secretome,  somatonome,   systeome,  toxicomics,  transcriptome,  translatome,  secretome,  unknome,  vaccinome,  variomics...   -­‐omics  Mania     An  omics  is  a  neologism  referring  to  a  broad  field  of  study  in  biology,  ending  in  the   suffix  ''-­‐omics''  such  as  genomics,  proteomics  or  Interactomics.  The  related   neologism  '''omes'''  are  the  objects  of  study  of  the  field  such  the  genome  or   proteome,  respecIvely  (''omes''  stems  from  the  Greek  for  'all',  'every',  'whole'  or   'complete').     Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    19   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Different  -­‐omics  sciences  describe  many  levels  of  biomolecular  organizaSon   –  but  if  used  in  isolaSon  may  give  misleading  inferences  about  the  system!!!   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    20   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Strana    21   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   JEDEN  GENOM,  DVA  PROTEOMY   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    22   ©  Ondřej  Slabý,  2009   From  220  publica[ons  in  the  previous  millennium  (‘94-­‐’99)   To  21,350    (!!!)  publica[ons  in  this  millennium  (‘00-­‐’05)   0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 Papers Reviews proteomics          886,000      hits  (2004)                                                            4,700,000  hits  (2005)     genomics        2,070,000      hits  (2004)                                            16,000,000    hits  (2005)   PROTEOMIKA   GENOMICS  81975   PROTEOMICS  36494   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    23   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Co  je  to  proteomika?   Proteomika  je  obor,  který  se  zabývá  systemaSckou  analýzou  proteinů     z  hlediska  jejich  idenSty,  množství  a  funkcí   Proteom Genom Ø Souhrn  všech  proteinů  v  daném  organismu   Ø Lidské  tělo  obsahuje  miliony  proteinů   Ø Exprese  proteinů  v  rámci  jednoho  organismu  se  liší   Ø Souhrn  všech  genů  v  daném  organismu   Ø Lidský  genom  obsahuje  20-­‐25.000  genů   Ø Genom  je  konstantní  celek   Exprese +posttranslační modifikace +alternativní sestřih +alternativní zavinutí Proteomika Genomika   MarcWilkins,  1994   PROTEiny  exprimované  genOMem   Nárůst diverzity proteinů Ø  Posttranslační modifikace 1.  Připojení  funkčních  skupin  (acetát,  fosfát,  lipidy,  cukry)   2.  Modifikace  amino  skupin   3.  Strukturní  změny  (tvorba  disulfidických  vazeb,  proteoly[cké  štěpení)   Ø  Alternativní sestřih Ø  Alternativní zavinutí Posnranslační  modifikace   AlternaSvní  zavinud   AlternaSvní  sestřih   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    24   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    25   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Přístupy  k  proteomickému  studiu     Podle  cíle:   proteomika  analyGcká,  strukturní,  funkční,  …   Podle  způsobu  provedení:   proteomika  diferencíální,  high-­‐throughput…         High-­‐throughput  proteomika  je  zaměřena  na  rychlé  získávání  údajů  o   přítomnos[  bílkovin,  což  je  důležité  zejména  pro  screeningové  účely  ve   zdravotnictví,  zemědělství,  kontrole  potravin  atd.     High-­‐coverage  proteomika  se  zabývá  získáváním  údajů  o  sekvenci   aminokyselin  včetně  post-­‐translačních  modifikací  bílkovin  scílem  co   nejvyššího  pokryƒ  primární  struktury  (tj.  stanovením  pořadí  co  nejvyššího   počtu  aminokyselinových  zbytků  vbílkovině),  což  je  důležité  při  studiu  role   bílkovin  v  životních  procesech.     Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    26   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Funkční  proteomika   se  zabývá  nejen  funkcí  bílkovin,  ale  zejména  studiem  komplexních  biologických   procesů,  jejichž  pochopení  má  zásadní  význam  pro  studium  vývoje  organismu  či   mechanismu  a  léčby  nemocí.   Přístupy  k  proteomickému  studiu   Shotgun  proteomika  je  obecný  postup  pro  iden[fikacebílkovin,  kdy  je   neseparovaná  směs  bílkovin  nejprve  enzymově  rozštěpena  na  směs  pep[dů,  které   jsou  následně  separovány  vhodnou  metodou  (nejčastěji  HPLC)  a  potom   sekvenoványtandemovou  MS  (často  jsou  využívány  i  nespecifické  enzymy  např.   Proteinasa  K).     Úvod  do  molekulární  medicíny  5/72   Strana    27   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Obecné  schéma  klasického  proteomického  experimentu   Separace  směsi  bílkovin   Výběr  proteinů   pro  inden[fikaci   Štěpení  vybraných  roteinů     a  čištění  pep[dů   Získání  hmotnostních  spekter   Iden[fikace  proteinů   2D-­‐elfo,  chromatografie  LC,  a  jejich  kombinace   Enzyma[cké  či  chemické   štěpení  spotů  nebo  LC  frakcí,   čištění   Měření  přesné  hmotnos[/náboje  pep[dů     případně  jejich  fragmentů   Porovnání  hmotnostní  sady  pep[dů  s  údaji  dostupnými  v  databázích.   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    28   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Močovina,  thiomočovina  –   chaotropní  činidlo,  zvýšení  rozpustnos[,   denaturace  bílkovin   Redukčníčinidlo(DTT)  –   redukce  disulfidickýmůstků   Příprava  vzorku  pro  proteomické  analýzy   Analýza  „subproteomů“   cytoplasma,  ribosomy:  diferenciální  centrifugace   membránová  frakce:  diferenciální  centrifugace,  extrakce  detergenty   (TX-­‐114)  nebo  extrakce  Na2CO3   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    29   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Dvojrozměrná  gelová  elektroforéza  (2D-­‐ELFO)  –  SEPARACE   IEF   Celkový  náboj  proteinu(net  charge)  je  součtem    všech  jeho  nega[vních  i  pozi[vních  nábojů.   Kyselé  a  zásadité  skupiny  jsou  v  protonovány  a  deptrotonovány  v  závislos[  na  pH  okolí.   Amfoterní  molekula  (bílkovina)  v  elektrickém  poli  v  gradientu  pH  migruje  do  bodu,  kde  je  její   celkový  náboj  rovný  nule.   pH  tohoto  bodu  odpovídá  izoelektrickému  bodu  (pI)  dané  bílkoviny.       SDS-­‐PAGE  (Sodiumdodecylsulfat–polyakrylamidová   elektroforéza  elektroforéza)   Bílkoviny  se  rozdělujína  základě  jejich  MW   Záporně  nabité  SDS  tvoří  komplexy  s  bílkovinami  a  sƒní  náboje  proteinu   (1,4g  SDS  :1g  proteinu).  SDS  uděluje  proteinům  uniformní  náboj  na   jednotku  hmotnos[       Problémy  s  MS   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    30   ©  Ondřej  Slabý,  2009    2D-­‐ELFO   LIMITACE  2D-­‐ELFO!!!!   Bílkoviny  s  extrémním  pI   Bíloviny  nad  150  kDa   Ohromný  koncentrační  rozsah  (ng/l  až  g/l)   Membránové(hydrofobní)  bílkoviny   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    31   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Dvojrozměrná  gelová  elektroforéza  (2D-­‐ELFO)   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    32   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Diferenciální  dvojrozměrná  gelová  elektroforéza  (2D-­‐DIGE)        VÝBĚR  PROTEINŮ   Strana    33   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Sowwarové  vyhodnocení  2D-­‐gelů   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    34   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Směs proteinů Jednotlivé proteiny Peptidy Hmotnostní  spektra   pepSdů   IdenSfikace  proteinů   1. Separace 2D-PAGE 2. Izolace Štěpení trypsinem 3. Hmotnostní analýza Hmotnostní spekroskopie 5. Porovnání s databází 4. Sekvenční analýza Fragmentace peptidů Sekvence  pepSdů   Schéma  –  shrnud  klasického  proteomického  experimentu   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    35   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Hmotnostní  spektrometrie  (Mass  Spectometry  -­‐  MS)   IDENTIFIKACE   Separace  látek  podle  rozdílů  hmotnos[  (m)  a   náboje  (z)  s  využiƒm  elektrického  /   magne[ckého  pole.     Určovanou  fyzikální  veličinou  je  podíl  hmoty  a   náboje  (m/z),  při  znalos[  náboje  umožňuje   určit  molekulovou  hmotnost.     Výsledné  hmotnostní  spektrum  →  grafické   znázornění  četnos[  iontů  na  hodnotě  m/z     IONTOVÉ  ZDROJE   Potřeba  vysušení  a  ionizace  analyzovaných   molekul  -­‐  měkké  ionizační  techniky  (ESI,   MALDI)  →  měření  makromolekulárních  látek   (proteiny,  lipidové  komplexy,  polysacharidy)   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    36   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Techniky  ionizace  -­‐  elektrospray  (ESI)   jemná  technika  ionizace,  nezpůsobuje  fragmentaci  analytu   vzorek  rozpuštěn  v  těkavém  organickém  rozpouštědle   rozprašován  pomocí  nabité  mikrostříkačky   odpařování  rozpouštědla  →  molekulární  ionty  vstupují  do  spektrometru   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    37   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Techniky ionizace – matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Techniky  ionizace–Matrix-­‐Assisted  Laser  DesorpSon  IonizaSon  (MALDI) Smíchání  vzorku  s  matricí     vysušení  na  kovové  des[čce   Matrice  (kyselina  niko[nová,   dihydroxybenzoová)   -­‐  absorbuje  energii  laseru   -­‐  usnadňuje  odpaření   -­‐  předává  náboj  analytu   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    38   Typy  analyzátorů  MS  –  nejjednodušší  Time  of  Flight  (TOF)   Urychlení  iontů  v  elektrickém  poli  o  definovaných  vlastnostech   m/z  lze  určit  z  doby  letu  iontu  trubicí  analyzátoru   Další  typy  analytátorů  –  IT  (ion  trap-­‐iontová  past)  Q3  (trojitý  kvadrupól   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    39   ©  Ondřej  Slabý,  2009   PepSdové  mapování  (PepSde  Mass  FingerprinSng  –  PMF,  MS  a  MS/MS)   IdenSfikace  proteinů  z  roztoku  a  gelu   Srovnání  MS  pep[dového  spektra  s  informacemi  v  databázích  (AMK  sekvence  →   teore[cké  štěpy)   Interpretace  MS  dat   Programy  :  Mascot,     ProteinProspector   Databáze:   NCBI   Swissprot   MALDI-­‐TOF   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    40   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Tandemová  hmotnostní  spektrometrie     sekvenování  pepSdových  fragmentů   kvan[fikace  pep[dů  v  MS  módu:  SILAC   (Stable  isotope  labeling  by  amino  acids   in  cell  culture)   kvan[fikace  pep[dů  v  MS/MS  módu:  iTRAQ   (Isobaric  tags  for  rela[ve  and  absolute     quan[ta[on)     Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    41   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Post  Source  Decay  (PSD)   Při  vyšší  energii  laseru  →   fragmentace  pep[du     (kolize  mezi  ionty  analytu)   Pep[de  fragment     Sequencing-­‐  metoda     pro  sekvenování      pep[dů   Tandemová  hmotnostní  spektrometrie     sekvenování  pepSdových  fragmentů   vícekroková  separace  na  základě  m/z  (mulSple  MS)   -­‐ fragmentace  určitého  iontu:  Post  Source  Decay  (PSD),    Colission  Induced     Disocia[on  (CID)  -­‐  fragmentace  při  kontaktu  s  inertním  plynem  (dusík,  helium)  v  kolizní  cele   ProteinChips  and  SELDI  (Surface  Enhanced  Laser  DesorpSon/IonizaSon)   KvanSfikace  proteinů   byla  definována  na  počátku  devadesátých  let   1)  je  rozšířením  MALDI-­‐TOF-­‐MS   2  metoda  desorpce  a  ionizace  netěkavých   látek   3)  měření  proteinů  v  lineárním  módu  ak[vní   účast  povrchu  čipu  při  extrakci,  prezentaci   a  strukturní  modifikaci  daného  vzorku             Rozdíly  mezi  metodami  MALDI  a  SELDI   1)  v  prvotním  zpracování  samotného  vzorku   (inertní  versus  ak[vní  povrchy)   2)  soLwarové  vyhodnocení  získaných  dat   (hledání  biomarkerů)   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    42   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Proteinové  profily  získané    metodou  SELDI  umožňují  rozdělit     pacientky  s  karcinomem  prsu  do  skupin  analogicky  jako  u  DNA  čipů   Brožková  et  al.,  2008   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    43   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    44   - ProSlátkové  microarrays  :  kvan[ta[vní  array  vazba  proteinu  na  imobilizovanou   pro[látku  →  detekce  sendvičovou  metodou  (fluorescenčně  značená  pro[látka)            -­‐  Reverzní  array  :  spotované  lyzáty  probované  vždy  jednou  pro[látkou   Funkční  array  –  spotované  purifikované  proteiny  probované  fluorescenčně   značenou  látkou  (protein,  DNA,  jiné  biologicky  ak[vní  molekuly)         Proteinové  arrays   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    45   Tkáňové  arrays  (Tissue  MicroArrays    -­‐  TMA)   Molekulární  epidemiologie  –  definice  a  vymezení  oboru,  iden[fikace  molekulárních  rizikových  faktorů   vzniku  a  rozvoje  onemocnění,  analýza  vztahu  molekulárních  faktorů  a  vlivů  prostředí  na  rozvoj   nádorového  onemocnění,  význam  molekulární  epidemiologie  u  karcinomu  plic  a  kolorektálního   karcinomu   Molekulární  farmakologie  I  –  cílená  léčba  –  vývoj  nových  léčiv  =  iden[fikace  nových  molekulárních  cílů,   vysokovýkonný  screening,  tkáňové  kultury,  transgenní  zvířecí  modely,  poměr  rizik  a  prospěchu,   ekonomická  a  e[cká  hlediska  při  výběru  iden[fikovaných  cílu  a  vývoji  nových  léčiv       Náplň  příšd  přednášky   Take  home   Kompara[vní  genomová  hybridizace  (CGH)   Genomová  array  CGH  (aCGH)   SNP  čipy     ChIP-­‐on-­‐chip  technologie   Technologie  čipů  k  detekci  methylace  CpG  oblasƒ     Technologie  exonových  čipů     Proteomika     Obecné  schéma  klasického  proteomického  experimentu     Dvojrozměrná  gelová  elektroforéza  (2D-­‐ELFO)   Hmotnostní  spektrometrie  (Mass  Spectometry  –  MS,  ISE,  MALDI,  SELDI,  TOF,  tandemová  MS)   Proteinové  arrays   Tkáňové  arrays         Strana    46   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12   Strana    47   ©  Ondřej  Slabý,  2009   Dotazy?   Úvod  do  molekulární  medicíny  5/12