Adobe Systems
ÚLOHA E
1
Stanovení genotypu a aktivity alkohol dehydrogenasy z krve
C7195 - Pokročilé praktikum z biochemie

Adobe Systems
ÚLOHA E
2
Xenobiotika (xenos = cizí)
•  normálně se v organismu nevyskytují
•  nejsou nutné pro jeho zdravý vývoj
•  neslouží pro organismus jako zdroj energie.
Primárním zdroje xenobiotik
•chemický průmysl (PAH, PCB, benzen, fenoly, ....)
•kouření (PAH, aromatické aminy, ….)
•jídlo a alkohol (PAH, arylaminy, heterocyklické a  aromatické aminy, .…)
•aflatoxiny

Adobe Systems
ÚLOHA E
3
Silně lipofilní
Lipofilní
Polární
Hydrofilní
1.Fáze biotransformace
  aktivace/inaktivace
oxidace, redukce, hydrolýza
2. Fáze biotransformace
  aktivace/inaktivace
konjugační reakce
Akumulace v tukové tkáni
Polární
Hydrofilní
Extracelulární tekutiny – exkrece játry, ledvinami
Xenobiotikum

Adobe Systems
ÚLOHA E
4
•  zavedení polární funkční skupiny do molekuly lipofilní látky
       - OH, -NH2, -SH, = CO, - COOH
•reakce 1. fáze biotransformace: oxidace, redukce, hydrolýza
•během 1. fáze biotransformace může docházet jak ke snížení tak ke zvýšení toxicity
Nejčastější reakce je oxidace katalyzovaná:
Øcytochrom P - 450             (CYP450)
Øalkoholdehydrogenáza                               (ADH)
Ømonoaminoxidázy a diaminoxidázy          (MAO)
1. fáze biotransformace

Adobe Systems
ÚLOHA E
5
Cytochrom P450

Adobe Systems
ÚLOHA E
6
Oxidace katalyzované CYP450
•Hydroxylace alifatických a aromatických uhlovodíků
      (benzén a jeho deriváty, PAHs, aflatoxiny, alkany, PCB)
•     Epoxidace nenasycené dvojné vazby (styrén, vinylchlorid)
•     Hydroxylace aminů (anilin)
•      -O, -N a –S dealkylace
•     Dehalogenace (PCB, formaldehyd, dibenzodioxiny, dibenzofurany)

Adobe Systems
ÚLOHA E
7
CYP1A1
CYP1A2
CYP1B1
CYP3A4
CYP2C
2,3-epoxid
4,5-epoxid
9,10-epoxid
7,8-epoxid
Fenoly
4,5-diol
9,10-diol
7,8-diol
CYP1A1
CYP1A2
CYP1B1
7,8-diol-9,10-epoxid
Glutathion-konjugáty
GSTA1
GSTM1
GSTP1
DNA adukty
tpoison
1-OH
3-OH
6-OH
7-OH
9-OH
9-OH-4,5-oxid
9-OH-4,5-diol
DNA adukty
tpoison
B(a)P
EH
EH
CYP1A1
CYP1A2
CYP1B1
EH
Pokles aktivity má protektivní účinek
Pokles aktivity nese vyšší riziko

Adobe Systems
ÚLOHA E
8
Oxidace alkoholu katalyzovaná enzymy alkohol dehydrogenáza (ADH) a aldehyd dehydrogenáza (ALDH)
ethanol
ADH
(Alkohol dehydrogenáza)
NAD+
NADH + H+
NAD+
NADH + H+
ALDH
(Aldehyd dehydrogenáza)
CYP2E1
Kataláza
+ H2O2
- H2O
acetaldehyd
k. octová

Adobe Systems
ÚLOHA E
9
Zkoumaný polymorfismus
ADH1C (349 F/I)
Studie ukázaly, že jedinci nesoucí alelu 350 I/I mají zvýšenou aktivitu ADH.
Genotyp analyzován pomocí PCR a restrikční analýzy
Restriktáza SspI
rs698 - ADH1C*349Ile
rs698F: GGCTAAGAAGTTTTCACTGGA
rs698R: GCCGCTACTGTAGAATACAAAG

Adobe Systems
ÚLOHA E
10
Měření aktivity
http://toxnet.nlm.nih.gov/png/138-89-6.png
p-nitrosodimethyl anilin   +   NADH -----------à  ????
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b7/Pyrazole_structure.png
Pyrazol – inhibitor reakce

Adobe Systems
ÚLOHA E
11
2. fáze biotransformace
Obvyklé konjugační reakce:
•  konjugace s k. glukuronovou
•  sulfátová konjugace
•  glycinová konjugace
•  acetylace
•  metylace
•  glutathionová konjugace
Obvyklé konjugační reakce:
•  konjugace s k. glukuronovou
•  sulfátová konjugace
•  glycinová konjugace
•  acetylace (N-acetyltransferáza)
•  metylace
•  glutathionová konjugace (Glutathion-S-transferáza)
•Xenobiotikum se přes polární funkční skupinu navázanou v první fázi váže na vysokomolekulární
endogenní konjugační činidlo
•Konjugát má obvykle menší biologickou aktivitu,  vyšší rozpustnost ve vodě a vyšší molekulovou
hmotnost než původní látka (metabolit z 1. fáze)

Adobe Systems
ÚLOHA E
12
2. fáze biotransformace
Acetylace pomocí N-acetyltransferáz (NAT1 a NAT2)
•důležitá metabolická cesta pro látky obsahující aminoskupinu ve své  molekule
•  arylaminy, heterocyklické a  aromatické aminy, atd.

Adobe Systems
ÚLOHA E
13
NAT
CYP1A2
CYP1A2
hydroxylamin
hydroxylacetylamin
Arylamin
N-acetamid
N-acetoxy-ester
N-acetyl-acetoxy-ester
tpoison tpoison
Nitréniový ion
DAC
NAT
DAC
OAT
NOAT
OAT

Adobe Systems
ÚLOHA E
14
Konjugační reakce s glutathionem katalyzovaná Glutathion-S-transferázou (GST)
+ GSH
GST
•největší význam má membránově vázaná GST, protože se vyskytuje  v blízkosti CYP450
 =  Glutathion (GSH)
Glu                Cys              Gly