Jméno a UČO:

            Datum:



                                  Identifikace jednotlivých druhů

                                      Václavek ze vzorku půdy


VYHODNOCENÍ


A.        Uveďte koncentraci a na základě naměřených dat zhodnoťte čistotu izolované DNA.

B.        Na základě délky amplifikátu a výsledku restrikční analýzy určete, jaký druh václavky
obsahoval váš vzorek půdy, a výsledek zdůvodněte.

C.        Porovnejte separaci DNA fragmentů pomocí agarozové elektroforézy a HPLC.

D.       Na základě sekvencí jednotlivých druhů václavek z NCBI databáze zkuste navrhnout dvojice
specifických primerů a TaqMan sondu pro detekci Vámi identifikovaného druhu václavky.

















                                              ÚLOHA A

      Analýza izoenzymů askorbát peroxidasy (APX) pomocí nativní PAGE a aktivity phenylalanin
                                        amoniak-lyasy (PAL)



VYHODNOCENÍ


-          Srovnejte změny aktivity askorbát peroxidasy po aplikaci jednotlivých látek v závislosti
na čase.

-          Výsledek zdůvodněte.


-          Spočítejte aktivitu fenylalanin amoniak-lyasy (PAL) v čase 24h po aplikaci neznámého
vzorku v kat na g rostlinného pletiva.

-          Výsledky vyneste do grafu, kde budou srovnány změny aktivity PAL po aplikaci vašeho
neznámého vzorku s kontrolou (voda).

-          Výsledek zdůvodněte.
























                                              ÚLOHA C

                                Klonování PCR produktu do plasmidu



VYHODNOCENÍ


-          Uveďte přibližnou délku klonovaného PCR produktu

-          Uveďte celkový počet kolonií po transformaci.

-          Uveďte kvantitu a čistotu vyizolované plasmidové DNA.

-          Uveďte vypočítané hodnoty koncentrací plasmidové DNA pro jednotlivý počet kopií/µl.










































                                              Úloha D

                     Identifikace neznámého elicitinu na základě jeho aktivity




VYHODNOCENÍ


-          Na základě výsledku RealTime PCR vypočítejte metodami absolutní nebo relativní
kvantifikace za použití ΔΔCt metody, zdali dochází po přidání neznámého vzorku ve sledovaném
časovém intervalu (24h) ke zvýšení transkriptů vybraných genů a o jak velké zvýšení se jedná.

-          Z pořízených fotek vypočítejte dle vztahu z kapitoly „Vyhodnocení nekrózy“ míru nekrózy
po přímé infiltraci a taktéž po infiltraci skrze petiolu.

-          Na základě výsledků z RT-PCR a nekrotického působení určete, jaký efektor byl ve vašem
neznámém vzorku. Pro vyhodnocení použijte tabulku:


Tabulka 1: Schéma odpovědi rostlin tabáku na jednotlivé testované molekuly.

                                           Typ molekuly

                                              Nekróza

                                              RT-qPCR



                                         Přímá infiltrace

                                          Nasátí petiolou

                                                PR5

                                              ntPRP27

                                            Cryptogein

                                            -elicitin

                                                +++

                                                +++

                                                +++

                                                +++

                                             Infestin

                                            -elicitin

                                                +++

                                                -/+

                                                +++

                                                +++

                                           K. salicylová

                                            Fytohormon

                                                -/+

                                                -/+

                                                +++

                                                 +

                                               Voda

                                             Kontrola

                                                 -

                                                 -

                                                 -

                                                 -



Nekróza:




RT-PCR:

Relativní kvantifikace:


Absolutní kvantifikace:




Výsledky:

Náš neznámý vzorek indukoval .......krát zvýšenou/sníženou/nezměněnou expresi PR5

                                                   .......krát zvýšenou/sníženou/nezměněnou expresi
PI-1


Náš neznámý vzorek způsoboval ……..% nekrózu na listech tabáku po přímé infiltraci

                                                     .…….% nekrózu na listech tabáku po nasátí
petiolou



Dle výsledků výše byl v našem neznámém vzorku …………………………….. .

Odůvodněte:










































                                              Úloha E

                   Analýza polymorfismu pro ADH a stanovení její aktivity v séru



VYHODNOCENÍ

-          Vypočtěte specifickou aktivitu ADH (Ɛ[440 ]NDMA = 34·10^3 M^-1.cm^-1) v kat/ml séra













                                              Úloha F

                                     Analýza Leidenské mutace



VYHODNOCENÍ

-          Na základě výsledku restrikční analýzy určete, jaký genotyp genu pro FV obsahoval váš
vzorek krve a jestli jste nositeli Leidenské mutace.