U u l\l i Úloha A
S C I
Identifikace jednotlivých druhů Václavek ze vzorku půdy
TEORETICKÝ ÚVOD
V současné době je na světě rozlišováno přes 40 druhů václavek (rod Armillaria), které se vyskytují na všech kontinentech s výjimkou Antarktidy. Poprvé byl rod václavka identifikován v 18. století, ale až v roce 1973 objevení bifaktoriálního sexuálního inkompatibilitního systému umožnilo spolehlivě identifikovat jednotlivé druhy václavek. V Evropě bylo do současnosti identifikováno sedm druhů václavek, Armillaria borealis, cepistipes, ectypa, gallica, mellea, ostoyae a tabescens [2]. Václavky se vyskytují téměř na všech druzích porostů, mezi něž patří především listnaté a jehličnaté lesy, ovocné sady a parky. Výskyt jednotlivých druhů je omezen jednak klimatickými a geografickými podmínkami a na druhé straně výskytem vhodných hostitelů [2]. Václavky se v lese podílejí na rozkladu odumřelé dřevní hmoty, čímž v mnohém připomínají chování mykorhizních hub. V mnoha případech však přechází k nekrotrofnímu parazitizmu, resp. saproparazitizmu, na celé škále dřevin, především pak na smrku, borovici a dubu. Byly však pozorovány i na nahosemenných a krytosemenných rostlinách, na celé řadě bylin, na obilninách nebo na okrasných rostlinách. Každoročně pak způsobují obrovské škody na lesních porostech [1,2].
Některé druhy mohou být obligátními saprotrofy, avšak všechny druhy jsou schopné napadat stresem oslabené hostitele. Některé druhy dále produkují antibiotické látky, které jim pomáhají udržet kontrolu nad infikovaným hostitelem [2]. Jednotlivé druhy václavek se liší jednak svou patogenitou a také spektrem napadaných hostitelů. Proto je z hlediska lesního hospodářství velmi důležité odlišovat od sebe jednotlivé druhy.
V současné době jsou k identifikaci jednotlivých druhů václavek nejvíce používané párové testy objevené Hinkitou v roce 1973, avšak v poslední době se k identifikaci začínají používat molekulárně-biologické metody, mezi něž především analýza restrikčních fragmentů ribozomální DNA.
Reštrikční analýza
Reštrikční endonukleasy jsou enzymy, které rozpoznávají ve dvoušroubovicové DNA specifickou sekvenci složenou obvykle ze 4 až 6 párů bazí a v tomto místě DNA specificky štěpí. Většina rozpoznávaných sekvencí restrikčními enzymy má dokonalou dvojčetnou rotační symetrii. Tyto sekvence jsou známy jako tzv. palindromy. Celá řada restrikčních enzymů (např. Hinf\, Mbo\) katalyzuje štěpení dvou vláken DNA v polohách symetricky rozmístěných okolo středu palindromové sekvence. Vznikají tak fragmenty s kohezními či lepivými konci. U
Pokročilé praktikum z Biochemie (122019)
1
m u n i SSL,.        Úloha A S C I
některých restrikčních enzymů (Alu I) naopak místo štěpení prochází přímo dvojčetnou osou palindromu. Vznikají pak fragmenty se zarovnanými či tupými konci [18].
Polymorfie délky restrikčních fragmentů (RFLP) poté poskytuje cenné informace o rozdílech mezi sekvencemi u jednotlivých druhů organizmů a je v současné době jednou z nejpoužívanějších metod v taxonomii a fylogenezi.
Identifikace na základě ribozomální RNA
Geny kódující ribozomální RNA jsou z hlediska taxonomického a fylogenetického velmi často používané. ITS oblast rDNA je velmi polymorfní, čímž se stává pro taxonomické a fylogenetické studie velmi výhodnou. Tato oblast leží mezi malou jadernou rDNA a velkou jadernou rDNA a je 5.8S rDNA rozdělena na oblasti ITS 1 a ITS 2 [3]. Pro amplifikaci této oblasti u hub byly navrženy primery ITS 1 a ITS 4 (obrázek 1).
ITSl
AR1
II	^-			lf
//    18S rDNA //	ITSl	5.8S	ITS2	23S rDNA li
				
AR2
ITS4
Obrázek 1: Umístění ITS oblasti a primerů ITSl, ITS4, AR1 a AR2 na rDNA [3,4]
Detekce václavek na základě RFLP analýzy ITS oblasti
Pro specifikou detekci václavek poté byly navrženy primery AR1 a AR2 ležící na okrajích oblastí ITSl a ITS2 (obrázek 1). Tyto primery se používají pro specifickou amplifikaci všech sedmi evropkých druhů václavek. Pro dosažení velmi vysoké citlivosti metody pro identifikaci václavek se vzorků půdy se využívá tzv. nested PCR, při které dochází k amplifikaci požadované oblasti pomocí dvou párů primerů. První pár, tzv. externí, se většinou vyznačuje nižší specifitou a slouží k před-množení požadované oblasti. Druhý pár, tzv. interní, je poté vysoce specifický a používá se k namnožení požadované oblasti z již před-množeného vzorku. Při identifikaci václavek ze vzorků půdy lze využit jako externí pár primerů primery ITSl a ITS4 a jako interní pár primery AR1 a AR2 [4].
Pro určení konkrétního druhu václavky se poté využívá RFLP analýza oblasti namnožené pomocí primerů AR1 a AR2 využívající reštrikční endonukleázy Hinf\ a Alu\ [4]. Délky restrikčních fragmentů pro jednotlivé druhy václavek jsou uvedeny v tabulce níže.
Pokročilé praktikum z Biochemie (122019)
2
muni SSL,. Úloha A SCI
Tabulka 1: Délky amplikonů a restrikčních fragmentů pro jednotlivé druhy václavek
Izolát	Délka amplikonů (bp) ITS/AR	Reštrikční fragmenty Hinfl (bp)	Reštrikční fragmenty Alu\ (bp)
A. borealis Ala	868/711	293, 172, 56, 31, 75, 68	41, 97, 180, 222, 323
A. cepistipes 204b	868/711	293, 227, 43, 132	41, 97, 180, 222, 323
A. gallica 147b	868/711	294, 227, 43, 63, 69	41, 97, 180, 222, 323
A. mellea 184b	882/724	148, 159, 401	40, 47, 97, 149, 214, 325
A. ostoyae C2a	870/713	294, 228, 31, 75, 69	41, 97, 180, 222, 323
A. tabescens T3a	847/690	295, 125, 93, 32, 129	35, 70, 96, 138, 181, 327
Literatura
1. Jankovský L. 1997. Biologie Václavek, Dizertační práce MZLU, Brno.
2. Shaw C.G., Kile, G.A. 1991. ARillaria Root Disease, Agriculture Handbook 691, Department of Agriculture. Washington D.C., United States
3. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Aplications: 315-322, Academic Press, Inc.
4. Lochman J, Sery O, Mikes V. 2004. The rapid identification of European Armillaria species from soil samples by nested PCR. FEMS Microbiol Lett. 1;237(1):105-10.
POSTUP PRÁCE
Izolace DNA z půdy pomocí izolačního kitu DNeasy® PowerSoil DNA
1. Do PowerBead zkumavky navažte přibližně 250 mg vzorku půdy a vortexujte.
2. Přidejte 60 u.1 roztoku Cl a několikrát promíchejte obracením zkumavky nebo vortexujte.
3. Umístěte rozbíječi zkumavky vodorovně a vortexujte maximální rychlostí 10 minut.
4. Centrifugujte 30 sekund při 10 000 x g.
5. Přeneste supernatant do čisté 2 ml mikrozkumavky.
Poznámka: Očekávejte 400 až 500 u.1 směsi. Směs může stále obsahovat určité množství půdních částic.
6. Přidejte 250 u.1 roztoku C2 a vortexujte 5 sekund. Inkubujte 5 minut na ledu.
7. Centrifugujte 1 minutu při pokojové teplotě a při 10 000 x g.
8. Přeneste do čisté 2 ml mikrozkumavky (přiložena) maximálně 600 u.1 supernatantu.
9. Přidejte 200u.l roztoku C3 a krátce vortexujte. Inkubujte 5 minut na ledu.
10. Centrifugujte 1 minutu při pokojové teplotě při 10 000 x g.
11. Přeneste do čisté 2 ml mikrozkumavky (přiložena) maximálně 750 u.1 supernatantu.
12. Přidejte 1200 u.1 roztoku C4 a vortexujte 5 sekund.
Pokročilé praktikum z Biochemie (122019)
3
m u li i SSL,*        Úloha A S C I
13. Přeneste přibližně 675 jllI na MB spin kolonku a centrifugujte 1 minutu při 10 000 x g při pokojové teplotě. Vylijte přefiltrovanou kapalinu a přidejte dalších 675 u.1 směsi do kolonky a centrifugujte 1 minutu při 10 000 x g při pokojové teplotě. Přidejte do kolonky zbytek směsi a centrifugujte 1 minutu při 10 000 x g při pokojové teplotě.
Poznámka: Každý vzorek je nutné rozdělit na tři dávky.
14. Přidejte 500 u.1 roztoku C5 a centrifugujte 30 sekund při 10 000 x g při pokojové teplotě.
15. Vylijte proteklou kapalinu.
16. Centrifugujte znovu 1 minutu při 10 000 x g při pokojové teplotě.
17. Opatrně přeneste kolonku do čisté 2 ml mikrozkumavky (přiložena). Zabraňte potřísnění kolonky roztokem C5.
18. Přidejte 100 u.1 roztoku C6 doprostřed bílé membrány uvnitř kolonky a centrifugujte 30 sekund při pokojové teplotě při 10 000 x g.
19. Vyjměte kolonku. DNA ve zkumavce je nyní připravena pro další použití.
Měření čistoty izolované DNA pomocí přístroje Nano-fotometr
1. Na fotometru nastavte měření koncentrace dsDNA.
2. Na čočku měřící kyvety nepipetujte 2.5 ul PCR vody a zakryjte vrškem s faktorem 10
3. Zmáčkněte tlačítko pro měření Blanku (BLANK).
4. Čočku a vršek otřete tampónem a poté na čočku napipetujte 2.5 ul vzorku DNA.
5. Zakryjte čočku vrškem s faktorem 10 a zmáčkněte tlačítko pro měření vzorku (SAMPLE)
6. Vytisknete hodnoty čistoty A260/280, A230/260 a naměřené spektrum.
Měření koncentrace izolované DNA pomocí přístroje Qubit
1. Smíchejte v 0.5 ml zkumavce 195 ul IX dsDNA HS Working Solution roztoku s5 ul izolované DNA a změřte na přístroji Qubit 4.0 koncentraci DNA.
Příprava 1. Reakční směsi nested-PCR
Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
Primery ITS1+ITS4 (1 uM)     1.5 ul RedTaq Mix 2x konc 15 ul
PCR voda_11.5 ul
DNA 2 ul
Reakční směs jemně promíchejte a krátce stočte a vložte do cycleru. Na cycleru nastavte následující program:
Pokročilé praktikum z Biochemie (122019)
4
m u m i biochemie
SCI
Úloha A
5j
95°C 2.5min
95°C 30s
55°C 30s 35x
72°C 20s
Příprava 2. Reakční směsi nested-PCR
Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
Primer AR1+AR2 (5 uM) 4.0 ul RedTaq Mix 2x kone 25 ul
PCR voda_16.0 ul
1 PCR reakce 5.0 ul
Reakční směs jemně promíchejte a krátce stočte a vložte do cycleru. Na cycleru nastavte následující program:
95°C 2.5min
95°C 30s
60°C 30s 45x
72°C 20s
Reštrikční analýza PCR produktu
Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
PCR reakční směs 20.5 ul
10 x Green Reakční pufr 2.5 ul Enzym Hinf\ 2.0 ul
Reakční směs jemně promíchejte, krátce stočte a inkubujte lh při 37°C.
Analýza Restrikčních fragmentů pomocí agarózové elektroforézy
Připravte 2% agarozový gel - navažte 1,6 g agarozy, přidejte 80 ml lx TAE pufru a agarozu důkladně rozvařte v mikrovlně troubě. Poté zchlaďte agarozu na cca. 70°C, přidejte 5 ul GelRed, promíchejte a nalijte do připravené vaničky s hřebínkem. Nechte asi 15 minut tuhnout.
Pokročilé praktikum z Biochemie (122019)
5
m u ih úloha a
S C I
Poté vložte nalitý gel do elektroforetické vaničky s cca. 200 ml lx TAE pufru a vyndejte hřebínek. K restrikčním směsím a ke zbytku PCR reakce přidejte 2 ul Nanášecího pufru. Naneste vzorky na gel v následujícím pořadí: Délkový marker - PCR produkt - RA Hinfl
Analýza Restrikčních fragmentu pomocí HPLC
Do insertu napipetujte 10 ul směsi po reštrikční analýze a 10 ul PCR vody. Insert vložte do HPLC přístroje HP 1100 Serieš, na kolonu nastříkněte 15 u.1 vzorku a spusťte následující metodu, ve které je použita TSK-gel DEAE NPR kolona a průtok činí 1 ml/min:
Roztok A Roztok B
10 mM Tris-HCI (pH = 9.0); 0.8 M NaCI 10 mM Tris-HCI (pH = 9.0)
Gradient
T (min)	% B
0	62.5
0.1	50
0.11	50
3	35
10	25
10.5	0
11.5	0
11.51	0
11.70	62.5
14.50	62.5
VYHODNOCENÍ
A. Uveďte koncentraci a na základě naměřených dat zhodnoťte čistotu izolované DNA.
B. Na základě délky amplifikátu a výsledku reštrikční analýzy určete, jaký druh václavky obsahoval váš vzorek půdy, a výsledek zdůvodněte.
C. Porovnejte separaci DNA fragmentů pomocí agarozové elektroforézy a HPLC.
D. Na základě sekvencí jednotlivých druhů václavek z NCBI databáze zkuste navrhnout dvojice specifických primerů a TaqMan sondu pro detekci Vámi identifikovaného druhu václavky.
Pokročilé praktikum z Biochemie (122019)
6