Konduktometrické
Impedimetrické
Bez elektrochemické transformace analyzované látky
S vnitřním elektrolytem
Coated wire
ISE
FED
LAPS
Potenciometrické (I=0)
S membránou a vnitřním elektrolytem
S membránou
Elektrokatalytické
Mikroelektrodové
Amperometrické (I<>0)
Zahrnující elektrochemickou transformaci
Elektrochemické senzory
Analyte
selective (bio)sensing
element
transducer
Signal
 Vysoký stupeň specifity k cílovému analytu (resp. cílové skupině analytů)
 Stabilita při provozních podmínkách (teplota, pH, iontová síla)
 Opakovatelnost měření
 Bez kontaminace měřeného vzorku
 Reprodukovatelnost přípravy
 Doba odezvy
 Snadná údržba
 Nízká cena a vysoká doba života
Požadavky kladené na senzory
 Citlivost je změna signálu senzoru (po ustálení odezvy) v důsledku
změny koncentrace analytu
 Detekční limit (změna koncentrace analytu, která způsobí měřitelnou
odezvu, S/N=3 )
 Selektivita: Schopnost senzoru měřit pouze jeden parametr, u
chemických sloučenin pouze jeden analyt.
out
in
dI
S=
dI
Specifikace senzoru
Sensors´ signals
Artificial neural network
Compound 1 Compound 2
Senzory, které nejsou
perfektně selektivní mohou
být zapojeny do
senzorových polí, analýza
signálu využívá metod
umělé inteligence.
Pravdivost, přesnost, správnost
Správnost (accuracy): Stupeň shody, se kterou měřící systém poskytuje „opravdovou“
hodnotu měřené veličiny (vyjadřována ve formě odchylky, systematické chyby).
Přesnost (precision): Rozdíl hodnot poskytovaných měřícím systémem při opakování
měření (vyjadřována směrodatnou odchylkou).
Správnost + přesnost = pravdivost
high accuracy
low precision
low accuracy
high precision
high accuracy
high precision
Amplification / filtering / A/D conversion
Data storage and processing
Output / control
Active surface
Transducer
Signal
smart
sensor
sensor
integrated
sensor
sensor system
Integrace senzoru s elektronikou
Potenciometrické senzory
 Vyžadují senzor a referentní elektrodu.
 Potenciál mezi nimi je měřen (mili)voltmetrem s (velmi) vysokým vstupním
odporem.
 Široce využívány ve formě iontově selektivních elektrod.
 Lineární odezva na logaritmus koncentrace testované látky.
Membránový potenciál reflektuje
gradient aktivity iontů analytu ve
vnitřním a vnějším (měřeném) roztoku.
 pro konstrukci ISE je klíčové najít materiál, který je schopen selektivně
vázat analyt
 tento materiál je inkorporován do membrány, která musí být vodivá
(alespoň trochu).
Membrány:
 skleněné (H+, pro ostatní kationty speciální skla (přídavek Al2O3 nebo B2O3
umožňuje navázání jiných kationtů než H+ (Na+, Li+, NH4
+, K+, Rb+, Cs+ a Ag+)
 krystalické membrány (monokrystal nebo homogenní směs rozpráškovaného
materiálu slisovaná pod vysokým tlakem P, d~10 mm, šířka: 1-2 mm. Vodivost:
dopování nebo nestechiometrie, Ag+ v AgCl nebo Ag2S, Cu+ v Cu2S. Fluoridová
Elektroda: stanovení F-, LaF3 krystal dopovaný EuF2).
 kapalné membrány (organické s vodou nemísitelné kapaliny, kterými je
napuštěna pórovitá (PVC) membrána s iontověměničovými vlastnostmi nebo
neutrální makrocyklické sloučeniny schopné selektivně navázat analyt v jejich
kavitách)
Ca2+ elektroda
Ca2+ + 2(RO)2PO2- → Ca [ (RO)2PO]2
R=C16- C18
K+ elektroda - valinomycin
„Coated wire“ potenciometrické senzory
CWE může být zlepšena
vložením vrstvy vodivého
polymeru mezi kovovou
elektrodu a iontově selektivní
vrstvu. Na tuto modifikaci lze
nahlížet jako na náhradu
vnitřního elektrolytu tradiční
ISE.
Další zjednodušení je přímá
inkorporace rekogničního
elementu do polymerní vrstvy.
Detailní teorie činnosti těchto
zařízení neexistuje.
Iontově selektivní membrána je přímo nanesena na vodivý substrát
Lambda sonda
•Potenciometrický senzor podobný
pH elektrodě
•Membrána je z ZrO2, pracovní
teplota je 350°C
•Elektrody jsou z porézní platiny
•λ<1: bohatá směs
ISFET
Si O Si O Si
O
OH
OH2
+ roztok
gate
ISFET = ion selective field effect transistor
LAPS senzor
LAPS = light addressable potentiometric sensor
 čip má jen jeden kontakt (nevyžaduje
přívody ze strany měřeného roztoku)
 ozářením modulovaným IR světlem dojde
ke vzniku fotoproudu, který je ovlivněn
nábojem na povrchu senzoru
 poziční citlivost (2D zobrazení)
 inherentní pH citlivost SiO2 (Ta2O5 aj.)
povrchu nebo běžné IS membrány
Amperometrické senzory s předřazenou membránou
CO + H2O CO2 + 2H+ + 2eH2S
+ 4H2O H2SO4 + 8H+ + 8eNO
+ 2H2O HNO3 + 3H+ + 3eH2
2H+ + 2e-
2HCN + Au HAu(CN)2 + H+ + eNO2
+ 2H+ + 2e-  NO + H2O
Cl2 + 2H+ + 2e-  2HCl
O3 + 2H+ + 2e-  O2 + H2O
Clarkova kyslíková elektroda
Amperometrické senzory - biosenzory
Prof. Leland C. Clark
Father of biosensors
1918-2005
Glukosa oxidasa (EC1.1.3.4)
"A much used and much loved enzyme in biosensors"
• holoenzym je tvořen dvěma identickými
podjednotkami (80kDa)
• jedna podjednotka obsahuje FAD, druhá váže
glukosu
•obsahuje FAD jako kofaktor
• levný, dostupný v gramových množstvích
• glykoprotein
• odolný – optimum 70°C
• mezi 20 a 30°C aktivita téměř nezávisí na teplotě
• nachází se např. na povrchu medu, kde reaguje s
glukosou a kyslíkem, vzniklý peroxid vodíku působí
antimikrobiálně
O
OH
H
H
H
OH
OH
H OH
H
OH
O
O
H
H
H
OH
OH
H OH
OH
+ O2
EC1.1.3.4
+ H2O2
+H+
Xanthin oxidasa (1.14.21.1)
• 270kDa,
• 2xFAD, 2x molybdenopterin, 2x [2Fe-2S]
ferredoxin
• hypoxanthin, xanthin a kyselina močová jsou
produkty metabolismu purinů
hypoxanthin + O2 → xanthin + O2
.xanthin
+ O2 → kyselina močová + O2
.-
2 O2
.- + 2 H+ → H2O2 + O2
N
NH
N
N
H
O
NH
NH
N
N
H
O
O NH
NH
NH
N
H
O
O
O
komerční
(mikrometrové rozměry) BM
nano BM
Berlínská modř
 pravděpodobně nejlepší a
nejstudovanější mediátor
redukce H2O2
„artificial peroxidase“
-750 -500 -250 0 250 500
-300
-250
-200
-150
-100
-50
0
50
E (mV vs. Ag / AgCl)
I(A)
-750 -500 -250 0 250 500
-90
-70
-50
-30
-10
10
E (mV vs. Ag / AgCl)
I(A)
0 2 4 6 8
-240
-200
-160
-120
-80
-40
0 mV
-200 mV
-400 mV
H2O2 (mM)
I(A)
0 2 4 6 8
-60
-40
-20
0
0 mV
-200 mV
-400 mV
H2O2 (mM)
I(A)
Problém modifikace Berlínskou modří – redukovaná forma (Prussian White) je
rozpustná ve vodě. Existuje rozsáhlá literatura zabývající se stabilitou Berlínské modři
vůči redox cyklování (proces je termodynamicky nestabilní, ale kineticky pomalý).
Většina sensorů využívá in situ vytvořené filmy BM. Nanostrukturování může, jak
bylo ukázáno, zlepšit charakteristiky senzoru (reverzibilita, linearita). Nicméně, vrstvy
jsou náchylné k dissoluci. Tvorba rozpustných forem BM je snadnější u vyšších pH. V
literatuře lze nalézt poklesy katalytického proudu H2O2 3x – 20000x při přechodu od
pH=3 k pH = 6.
2 K2FeII[FeII(CN)6] + H2O2 + 2 H+ = 2 KFeIII[FeII(CN)6] + 2 H2O + 2 K+
KFeIII[FeII(CN)6] + K+ + e- = K2FeII[FeII(CN)6]
KFeIII[FeII(CN)6] = 2/3 K+ + 2/3 e- + K1/3[FeIII(CN)6]2/3[FeII(CN)6]1/3
Fe4
III[FeII(CN)6]3 + 4 K+ + 4 e- = K4Fe4
II[FeII(CN)6]3
Fe4
III[FeII(CN)6]3 + 3 A- = 3 e- + Fe4
III[FeIII(CN)6A]3
„nerozpustné“ PB
PW (Everitt salt)
BG
0.75 V vs. Ag/AgCl
„rozpustné“ PB 0 V vs. Ag/AgCl
Amperometrické elektrody s membránou – NO selektivní elektroda
Lidský vlas
Vlákno
 pretreatment
 elektropolymerace NiTMHPP
 pokrytí Nafionem
N
N N
N
Ni
HO
HO
OH
OH
OCH3
OCH3
H3CO
OCH3
[-(CF2-CF2)n-CF-CF2-]m
|
O-CF-CF2-O-CF2-SO3-M
|
CF3
+ -
Proudové hodnoty (a. u.), dosahované v
průběhu cyklování potenciálu (0 až 2,9 V,
50 Hz) při aktivaci povrchu uhlíkového
vlákna senzoru v PBS (2 % NaCl).
Znázorněno prvních 10 sekund procesu.
Detail průběhu proudu (a.u.) v procesu
aktivace uhlíkového vlákna mikroelektrody
(výsek z levého obr.– cyklování potenciálu
0 až 2,9 V, 50 Hz)
„Pretreatment“
 mild pretreatment
 strong pretreatment
Polymerace 0,4 mM Ni-TMHPP
-700
-600
-500
-400
-300
-200
-100
0
100
0 200 400 600 800 1000 1200
E/mV (vs. Ag/AgCl)
I/nA
Elektropolymerace NiTMHPP
•100 cyklů, 100 mV/sec
•Voltamogramy neobsahují píky
Ni(II)/Ni(III)
Vrstva Nafionu
•Zlepšuje „skladovací“ charakteristiky senzorů
•Téměř nepřispívá k selektivitě senzoru
T. Malinski, Z. Taha, S. Grunfeld, A.
Burewicz, P. Tomboulian, F. Kiechle,
Measurement of nitric oxide in biological
materials using a porphyrinic microsensor.
Anal. Chim. Acta 279 (1993) 135-140.
Selectivity:Carbon fiber
modification Ascorbate Dopamine Nitrite
Detection limit
NO [nM]
Literature
Ni-TMHPP / Nf 1 : 18000 1 : 400 1 : 600 1,5
Nf./m-PD+resorcinol 1 : 2000 1 : 200 1 : 600 60 – 80 [1]
Nf./o-PD 1 : 750 1 : 18 1 : 780 6 [2]
Nf./o-PD: 1 : 756 1 : 175 1 : 935 35 [3]
Ni-TMHPP/Nf.: 1 : 986 1 : 4 1 : 181 76 [4]
Nf.: 1 : 612 1 : 2 1 : 302 47 [5]
Odezva senzoru v oblasti
nanomolárních koncentrací NO
8 x 4 nM NO
1 x 20 nM NO
Před nástřiky roztoku NO byla elektroda
několik hodin polarizována při
pracovním potenciálu tak, aby proud
pozadí poklesl až na cca 15 pA.
Vlastnosti NO senzoru
A – miniaturní Ag/AgCl elektroda
B – senzor
C – pomocná elektroda
RAW 264.7 (1x106)
DMEM + 10% FBS (5% CO2, 37oC)
MEM (NaHCO3, konstantní pH)
Schéma experimentu:
RAW 264.7 vysadíme na kultivační misku
a kultivujeme v DMEM médiu v inkubátoru
při 5% CO2 a 37oC.
1. Počet buněk stanovujeme pomocou Coulter
Countru (Coulter®, Coulter Electronics LTD,
England)
2. Buňky o koncentraci 1x106/800 µl
inkubujeme 60 min. v 800µl MEM média.
3. Následně do zkumavek s adherovanými
buňkami aplikujeme lipopolysacharid (LPS)
– 5ng/ml.
4. Mikrozkumavku umístíme do měřící
komůrky a snažíme se umístiť elektrodu na
dno, až k povrchu buněk.
5. Zapojíme elektrodu a spustíme měření.
6. Po ukončení pokusu a odpojení elektrody
odpipetujeme médium.
7. V médiu následně pomocí Griessovy metody
spektrofotometricky stanovujeme koncentraci
dusitanů (NO2-), ktoré jsou hlavním
koncovým metabolitem NO.
Měření NO produkovaného buňkami
7 8 9 10 11 12 13 14
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
MEM
AMT
AMT
Time (h)
I(nA)
0 2 3 4 5 6 16 20 C
0
50
100
150
200
-actin
iNOS
Time (h)
Density(a.u.)
0 5 10 15 20
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
RAW 264.7 without stimulation
RAW 264.7 stimulated by LPS
background corrected curve
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Time (h)
I(nA)
NO(nmol/h.106
cells)
0 4 8 12 16 20
0
5
10
15
20
25
0
5
10
15
Time (h)
NO2
-
(mol.L-1
)
NO(nmol/106
cells)
2-amino-5,6-dihydro-6-methyl-4H-1,3-thiazin
(AMT)
Výsledky
Sensitivity
(nA / μM NO)
Selectivity
Dopamine Nitrite Ascorbate
before after before after before after before after
Electrode 1 1.45 1.44 1:1060 1:443 1:570 1:542 >1:5000 >1:5000
Electrode 2 1.41 1.49 1:1156 1:335 1:500 1:428 >1:5000 >1:5000
0 500 1000 1500 2000
5.0×10-10
1.0×10-09
1.5×10-09
2.0×10-09
NO
NO
ascorbate
ascorbate
dopamine
nitrite
Time (s)
Current(A)
0 500 1000 1500 2000
5.0×10-10
1.0×10-09
1.5×10-09
2.0×10-09
NO
NO
ascorbate
ascorbate
dopamine
nitrite
Time (s)
Current(A)
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000
5.0×10-10
1.0×10-09
1.5×10-09
2.0×10-09
NO
NO
ascorbate
ascorbate
dopamine
nitrite
Time (s)
Current(A)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
5.0×10-10
1.0×10-09
1.5×10-09
2.0×10-09
NO
NO
ascorbate
ascorbate
dopamine
nitrite
Time (s)Current(A)
Testování parametrů
senzorů před a po
experimentu s buňkami