Cvičení: 12.12. od 8.00, A7 (2.17) - pláště, psací a kreslící potřeby Test: 19.12. od 9.00, A2 (2.11) - psací potřeby (odpovědi A,B,C,D) Zkouška/prezentace: 19.12. po testu, A2 (2.11) – max 6 studentů Další 2 termíny v lednu … A2 (2.11) – po 6-ti studentech Kvasinky … oblast vaší DP (ne samotná DP) - úvod do problematiky - výsledky z článku (ne starší než 5 let) - závěry, reference přednáška 15 + 5 minut Osnova (poslední) přednášky • Chromatin – Charakteristika kvasinkového genomu – Chromosomy – Evoluce (duplikace genomu …) – DNA-opravné mechanismy – SMC komplexy a struktura chromatinu • Závěry - haploidní genom - 12Mbp, 16 chromosomů (diploidní 2n, pivní kvasinky jsou polyploidní) vs 13Mbp/3 chromosomy - délka nejdelšího chromosomu XII se u různých S.c. - dle počtu (až 200) kopii rDNA v repetici, 262 tRNA (pro 64 kodonů) - krátké centromery a ARS (100bp) vs repetitivní centromery - geny (cca 6500) reprezentují 75% celkové sekvence (kompaktní) - redundantní (2000 genů duplikováno) – cca30% genomu vzniklo duplikacemi - <5% genů (280) obsahuje introny (0.5% genomu) vs většina genů s introny (4500 genů) - 3% Ty1-5 transposony (vs 46% u člověka) - kondenzovaný heterochromatin: centromery, telomery a HMR/HML vs 3 chromosmy jsou více kondensované Základní prvky kvasinkového genomu Saccharomyces cerevisiae vs S.pombe Pozorování DNA/chromosomů u kvasinek • Chromosomy jsou u kvasinek malé a těžko pozorovatelné v mikroskopu – barvení DNA na fixovaných preparátech pomocí DAPI (4,6-diamidino-2- phenylindol) • Použití fůzních proteinů-GFP (green fluorescence protein) pro studium dynamiky chromatinu (H2A-GFP, kinetochora-centromera) • TetR-GFP represor se váže na TetO sekvence (operon) zaintegrované v přesně definovaném lokusu • ChIP (chromatin immune precipitation) – specifické sekvence, ChIP-seq nebo „ChIP on CHIP“ • 3C, 4C … – chromatin conformation capture Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Pozadí = mtDNA - zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze tj. replikace - rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze - jádro se protahuje – začátek M fáze - u kvasinek se jaderná membrána nerozpadá - na začátku anafáze dochází k oddělení sesterských chromatid a jejich segregaci SPB-GFP barvení DNA v průběhu buněčného cyklu S.cerevisiae MT-cytoplasmatické -jaderné Marco et al, Cell, 2013 Organizace chromosomů FISH – fluorescence in situ hybridization (1992) Tadei a Gasser, Genetics, 2012 SPB v mitotickém jádře jsou centromery orientovány (přichyceny) k SPB (spindle pole body) v meiotickém jádře jsou telomery blíž SPB rDNA (repetice) RABL uspořádání Expanze genomů hub • kvasinky mají nejmenší genomy mezi eukaryoty AscomycotaBasidiomycota • 1500 Mya: Metazoa - Fungi • 1200 Mya: Ascomycota – Basidiomycota. • 1000 Mya: S. cerevisiae – Schizosacch. pombe • 840 Mya: S. cerevisiae – C. albicans • 170 Mya: (Pichia, Candida) – Kluyveromyces aj. • 150 Mya: WGD Evoluce kvasinek Dujon et al., Nature, 2004 Chatterjee et al, PLoS Genet, 2016 sekvenčně specifická centromera se patrně vyvinula z původně repetitivní/sekvenčně nespecifické centromery Evoluce centromer Centromera S. cerevisiae sekvenčně specifická centromera se patrně vyvinula z původně repetitivní/sekvenčně nespecifické centromery Konsensní sekvence S.c. centromer Chan et al., Trends in Cell Biol, 2005 Centromera S. cerevisiae Chan et al., Trends in Cell Biol, 2005 Carroll a Straight, Trends in Cell Biol, 2006 Eukaryotické centromery Centromery jsou definovány více strukturou chromatinu než jejich sekvencí Prakvasinka a duplikace genomu • srovnání kvasinkových genomů ukázalo na existenci „prakvasinky“ s 8-mi ancestrálními chromosomy (cca 4500 geny) • nejblíže anc. genomu je Lachancea kluveri (8 chromosomů, nejméně přeskupení v genomu = 15 - viz a-o) Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 • ancestrální kvasinka prošla celogenomovou duplikací (WGD) 8->16 chromosomů •některé kvasinky chromosom ztratili (např. Z. rouxii a A. gossypii) Evoluce centromer Přeskupování chrom. bloků u L.kluveri Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 15 přeskupení (a-o) nejblíže anc. genomu je Lachancea kluveri (8 chromosomů, nejméně = 15 přeskupení v genomu Přeskupování chrom. bloků u L.kluveri Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 • přeskupení prostřednictvím rekombinace (mikrohomologií) po zlomení chromosomu (DSB) • L.k. neztratil chromosom patrně způsobeno absencí genů DNL4, POL4, NEJ1 – důležité pro NHEJ mechanismus (oprava poškozené DNA např. dvouřetězcových zlomů, které jsou nutné pro fůze chromosomů i přeskupovaní => omezené přeskupování) 15 přeskupení (a-o) nejblíže anc. genomu je Lachancea kluveri (8 chromosomů, nejméně = 15 přeskupení v genomu Homologní rekombinace 1. MRX se váže na zlomené konce DNA. 2. Nukleolytická degradace 5’ řetězců 3. Vazba RPA na 3’ jednovláknové konce 4. Rad52 nakladá Rad51 rekombinázu na ssDNA (Srs2 helikáza odstraňuje Rad51). 5. Rad51-filament hledá homologní DNA (Rad54). 6. Tvorba D-smyčky 7. Prodloužení 3´ konce filamentu (DNA polymeráza δ) 8. Vznikají dvě „Holiday junctions“ rozrušený Sgs1-Top3-Rmi nebo rozštěpený endonukleázami (Mus81-Mms4, Slx1-Slx4, Rad1Rad10, Yen1). Upravené z Altmannová et al., Biomolecules, 2012 HR nutný pro opravu DSB, přepínání párovacího typu, restart zastavených replikačních vidliček, integraci DNA do genomu ale je nebezpečný pro repetitivní sekvence Redukce chromosomů telomera-telomera fúzemi Zygosaccharomyces rouxii ztratila 1 chromosom díky telomera-telomera fůzi 2 ancestrálních chromosomů (NHEJ) - současně ztratily centromeru (chromosom nemůže mít 2 centromery – problémy se segregací) Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 - rozlomení v centromeře a napojení vzniklých ramen na telomery jiných chromozomů (A. gossypii) - geny v oblasti telomer (neesenciální, málo transkribovány, malý evoluční tlak - mutují více než ostatní geny - telomery jako „kotlík“ evoluce = cooking pots of evolution) - při fúzi chromozomů se geny z telomerových oblastí dostávají dovnitř chromozomu (změna míry exprese uvnitř chromozomu) Redukce chromosomů fúzemi Nehomologické spojování konců Non-homologous end joining (NHEJ) Upravené z Altmannová et al., Biomolecules, 2012 1. Vazba MRX (Mre11-Rad50-Xrs2) komplexu, Ku heterodimeru (Yku70Yku80) na zlomené konce DNA 2. Vazba DNA ligázy IV (Dnl4) a jejích pomocných proteinů Lif1 a Nej1. 3. Hledání komplementarity mezi převisy dvou konců DNA. 4. Úprava konců - syntéza DNA (Pol4 DNA polymeráza) 5. Religace konců při opravě nekompatibilních konců většinou dochází k delecím nebo inzercím – HR je lepší, ale je potřeba homologní sekvence – NHEJ v G1 zatímco HR v G2/M – dobře rostoucí kultura kvasinek má významnou frakci buněk v G2/M (proto je v kvasinkách možná integrace homologních sekvencí – genetika – použít exponenciální kultury pro transformace) cca 30% genomu S.c. vzniklo duplikacemi => cca 2000 genů duplikováno nebo došlo k celogenomové duplikací (WGD) => a poté došlo k přeskupování a redukci segmentů – 30% genomu u S.c. je pozůstatkem celogenomové duplikace (nikoli duplikace segmentů či genů) Celogenomová duplikace – Saccharomycotina Ancestrální chromosom Evoluce metabolismu galaktózy – ztráty genů Hittingeretal.,PNAS,2004 - různé kvasinky využívají různe cukry (viz přednáška o určování kvasinek) - S. cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae, S. bayanus, S. castellii, S. kluyveri, a K. lactis využívají galaktosu – mají všechny GAL geny - S. kudriavzevii, C. glabrata, K. waltii, a E. gossypii nemohou využívat galaktosu (vyřazení jednoho GAL genu znemožní kvasince metabolismus galaktosy – vede k degeneraci i ostatních GAL – GAL4 TF je „pleiotropní“/širší – více zachován) blízký - pouze degenerace = pseudogeny (STOP …) vzdálené částečné nebo úplné delece genů a promotorů WGD GAL4 gen kóduje transkripční faktor (aktivátor), který se váže na UAS GAL1, GAL7, GAL10 … Regulace metabolické dráhy galaktózy Hittingeretal.,PNAS,2004 Johnston,MMBR,1987 průmyslově-specifická selekce na toleranci ke stresu (vyšší obsah etanolu 7-15%), využití cukru, specifické aroma, nižší schopnost reprodukce „očkováním“ předchozích pivních kultur do nových kvasných procesů (ztráta kontaktu s přirodním prostředím - ~75 000 generací) – např. ztráta schopnosti sporulovat (stále bohaté médium), rychlejší evoluce … nebo naopak zvýšení resistence vůči sulfátům (přidávaným kvůli konzervaci) mutace a duplikace v MAL genech – zlepšení schopnosti utilizace maltosy - nonsense mutace PAD1 a FDC1 (snížení produkce 4-vinyl guaiacolu odpovídajícího za nepříjemné aroma piva) … Gallone et al, Cell, 2016 vznik klášterních pivovarů „technologie“ piva ~3000 BC amplifikace genů nejvíce amplifikací v MAL genech (IMA2, IMA3, MAL31, MAL33, MAL32) u pivních kvasinek (rostou na maltose), zatímco ve vinných kmenech došlo k mnoha delecím těchto genů (ve vinném moštu maltosa není) – obecně více delecí než amplifikací (v genomech analyzovaných kvasinek) Gallone et al, Cell, 2016 mnoho pivních kvasinek je polyploidních – stres … Richardson et al, Science, 2017 snaha vytvořit „syntetický“ eukaryontní organismus Konsorcium (jako EUROFUN … projekty) Syntetické raménko kvasinkového chromosomu Syntetické raménko vytvářeno postupně (cca 10kbp fragmenty) – střídavě URA3 vs LEU2 markery pro selekci nových kmenů Dymond et al, Nature, 2011 • Zachováno pořadí genů … wt fenotyp (testovali UV, H2O2 …) • Odstraněny destabilizující repetitivní elementy (telomery, transposony) • Redundantní tRNA (z 275 kopii na 42 kódujících – na extrachromosom) • TAG na TAA stop kodony (TAG kodon uvolněn pro novou AMK) • unikátní PCRtagy (odlišení syntetického a wt chromosomu) • LoxPsym na vyštěpení non-essenciálních genů Syntetické raménko kvasinkového chromosomu Dymond et al, Nature, 2011 • Zachováno pořadí genů … wt fenotyp (testovali UV, H2O2 …) • Odstraněny destabilizující repetitivní elementy (telomery, transposony) • Redundantní tRNA (z 275 kopii na 42 kódujících – na extrachromosom) • TAG na TAA stop kodony (TAG kodon uvolněn pro novou AMK) • unikátní PCRtagy (odlišení syntetického a wt chromosomu) • LoxPsym na vyštěpení non-essenciálních genů Syntetické raménko kvasinkového chromosomu Dymond et al, Nature, 2011 • Zachován fenotyp (teplotní citlivost, morfologie kolonií, růst na G/E …) SC=Syntetické kompletní médium SD=Syntetické minimální medium GE=glycerol/etanol Organizace chromosomů FISH – fluorescence in situ hybridization (1992) Tadei a Gasser, Genetics, 2012 SPB v mitotickém jádře jsou centromery orientovány (přichyceny) k SPB (spindle pole body) v meiotickém jádře jsou telomery blíž SPB rDNA (repetice) RABL uspořádání rDNA - repetice • rDNA kóduje geny pro ribosomální RNA (chromosom XII) • Je vysoce konzervativní • Identifikace a odlišování kvasinkových druhů • Sledování evolučních trajektorii • Až 200 kopii v řadě za sebou • Problém s homologní rekombinací (lokalizace do jadérka) • Problém s replikací – musí probíhat ve stejném směru jako transkripce (probíhá v S-fázi – kolize) rDNA (repetice) 3D organizace chromosomů v S.c. 3C – chromosome conformation capture Duan et al, Nature, 2010 Duan et al, Nature, 2010 Chromosom XII obsahuje rDNA repetice, které jsou lokalizovány do jadérka – úsek nesousedí s žádnou z „jaderných“ částí – je izolován (z „bezpečnostních“ důvodů … syntéza ribozomů) Chromosom XII intrachromosomální interakce rDNA (repetice) Duan a spol, Nature, 2010 Všechny centromery jsou blízko sebe v mitotickém jádře jsou centromery orientovány (přichyceny) k SPB (spindle pole body) interchromosomální interakce Duanetal,Nature,2010 3D rekonstrukce chromosomů v kvasinkovém jádře modrý chromXII – jadérko s rDNA izolované zelený chromIII (MAT lokus) Kakui et al, Nat Genet, 2017 Kondenzace chromosomů v mitóze S. pombe má 3 chromosomy – diagram zachycuje intra- i interchromosomální interakce – centromery i telomery spolu … srovnání interfázních a mitotických chromosomů Kondenzin kondenzuje chromosomy intrachromosomální interakce větší mitotické smyčky jsou závislé na kondensinu Kakui et al, Nat Genet, 2017 Tanizawa et al., NSMB, 2017 Kakui et al, Nat Genet, 2017 Palecek a Gruber, Structure, 2015 Kondenzin – SMC komplexy SMC (Structure Maintenance of Chromosom) komplexy jsou konzervované od bakterií až po eukaryota kondensin konhesin SMC1 Scc1/Rad21 SMC3 Scc3 Marco et al, Cell, 2013 Haering et al, 2002, Mol Cell Kohesin je klíčový pro průběh mitosy – otevření kruhu v anafázi umožňuje segregaci Kohesin drží sesterské chromatidy SMC komplexy napomáhají při HR - kohesin přidržuje homologní chromosomy při sobě a napomáhá HR - SMC5/6 reguluje restart zastavených replikačních vidliček (limituje HR v repetitivních sekvencích) Palecek a Gruber, Structure, 2015