Osnova 4. přednášky
• Genetické metody
– Plasmidy
– Integrace do genomu
– Teplotně-sensitivní mutanty
– Tetrádová analýza
– Syntetická letalita, suprese
Výhody kvasinkového modelu
• Rychle se množící EUKARYOTNÍ mikroorganismy (90 min/dělení, 25-30°C)
• Vytváří kolonie na plotnách - mikrobiologické metody (otiskování ploten, kapkovací test
=>toxiny v plotnách – HU, MMS …)
• Stabilní haploidní i diploidní formy
• Haploidní buňky lze křížit na diploidní (heterozygotní mutanty)
• Diploidní buňky lze sporulovat a využít pro genetickou analýzu (tetrádová
analýza)
• Lze transformovat DNA (plasmidy i linearní)
• Centromerické a multicopy plasmidy
• Vysoká frekvence homologní rekombinace (lineární DNA)
• Lze připravovat deleční, inzerční a mutantní kmeny
• Vydrží v >15% glycerolu na -70°C „indefinitely“
• Techniky barvení (např. aktinový cytoskelet = phaloidin, buněčná stěna = calcofluor ...
+ GFP in vivo)
• Techniky synchronizace buněk
• S.c. má kompaktní genom – knihovny s genomovou DNA (ne cDNA)
• Kompletně osekvenovaný genom (genomové aplikace)
• EuroFan projekt – delece všech S.c. genů (+GFP, +2-hybrid)
• Mikročipy - expresní profily za různých podmínek
• Řada životních dějů má analogii v procesech v savčích buňkách
(lidské geny testovány v kvasinkách - nemoci, metabolismus,
regulační mechanismy)
Nevýhoda – malé buňky, malé organely (např. nejsou vidět chromosomy – SMC)
Chromosom III
(nejmenší)
CEN, ARS, TEL, Ty1-5
obsahuje MAT lokus
Nomenklatura pro S.c.:
YCRXXw:
Y=yeast
C= 3. chromosom
R= pravé raménko
XX=pořadové číslo
w/c=Watson/Crick
LEU2 – gen
Leu2p - protein
leu2 – delece
leu2-1 – mutace
(identifikační číslo alely)
LEU2::HIS3 – inzerce
HIS3 genu v lokusu
LEU2
Nomenklatura pro S.p.:
SPAXXXX:
SP=S. pombe
A= 1. chromosom
…
Forsburg: NRG, 2001
Baudat a Nicolas, PNAS, 1997
Laboratorní kvasinkové kmeny
S. pombe – „501“
Genotype: h- ura4-18 leu1-32 ade6-704
S. Cerevisiae – „S288C“ – 1. osekvenovaný kmen
Genotype: MATα SUC2 gal2 mal mel flo1 flo8-1 hap1
Notes: Strain used in the systematic sequencing project, the sequence stored in SGD. S288C does not form
pseudohyphae. In addition, since it has a mutated copy of HAP1, it is not a good strain for mitochondrial studies. S288C
strains are gal2- and they do not use galactose anaerobically.
References: Mortimer and Johnston (1986) Genetics 113:35-43.
Sources: ATCC:204508
„W303“ – nejčastěji používaný laboratorní kmen
Genotype: MATa/MATα leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15
Notes: W303 also contains a bud4 mutation that causes haploids to bud with a mixture of axial and bipolar budding patterns.
In addition, the original W303 strain contains the rad5-535 allele.
References: W303 constructed by Rodney Rothstein
Sources: Biosystems:YSC1058
Dvojhybridní
systém:
auxotrofie – využívána pro selekci
Allele Reverts? Notes Molecular descriptiona Reference
ade2-101 yes
ochre mutation, red
colonies
G to T transversion at nucleotide
190, changing amino acid 64 from
a Glu to a STOP
Gai and Voytas, 2005
his3-200 no
Cold sensitive; high
frequency of petite
formation, especially
during transformation.
1 kb deletion, (-205 to 835)
Struhl 1985; Fasullo and Davis
1988
leu2-3,112 no double mutant
GTT-to-GCT missense change at
codon 69,
G insertion at nucleotide 249,
G insertion at nucleotide 792,
GAC-to-AAC missense change at
codon 300.
Hinnen et al. 1978;
Gaber and Culbertson 1982;
trp1-1 yes amber mutation
GAG-to-TAG amber (STOP)
nonsense change at codon 83
McDonald, et al. 1997
ura3-52 no - Ty1 insertion Rose and Winston 1984
Selekce
Forsburg: NRG, 2001
- geneticin (G418) – podobný kanamycinu (mistranslace)
- nourseothricin (NAT) – inhibitor ribosomalní proteosyntézy = miskodování
(Streptomyces noursei), rezistence pomocí nat1 genu (N-acetyltransferasa –
monoacetyluje NAT)
- hygromycin B – inhibuje translokaci v průběhu translace (aminoglykosid z
Streptomyces hygroscopicus), rezistence kódována hph genem z Klebsiella
pneumoniae
- phleomycin – interkaluje se do DNA a způsobuje DSB (zlomy, glycopeptid z
Streptomyces verticulus), rezistence kódována ble genem z S. hindustanus
Shuttle vektory
• vychází z 2m plasmidů nebo centromer (S.c.; 2m přítomné také v
Zygosaccharomyces bailii, Z. rouxii a Kluyveromyces drosophilarum)
• Kvasinková část – marker (URA3, NAT …), CEN-ARS (1 kopie) nebo 2m (~50 kopii
na haploidní buňku) začátek replikace
• Bakteriální část – Kan resistence, replikace
• Promotor, tag, MCS
– Kondicionální mutanty (fenotyp-funkce)
– Nadprodukce (suprese mutací nebo toxicita)
MET1
CUP1
MFA1
Methionin repressed
Indukovány mědí
MATa specifický (haploid specifický)
Sheng, Front in Microb, 2015FFA- free fatty acids, FAEE - fatty acid ethyl esters
Příprava monomerů pro výrobu plastů
– využití Candida tropicalis
Lu et al., JACS (2010)
• Candida tropicalis je schopna využít mastné kyseliny jako zdroj uhlíku
(acetyl-CoA)
• mutantní kmen (POX4, POX5) není schopen -oxidace a přeměňuje je
oxidací na di-karboxylové kyseliny (Picataggio et al, Biotechnology, 1992)
• pomocí flp rekombinasy odstranili geny oxidás (4 alkohol oxidásy) a
dehydrogenás (6 alkohol dehydrogenás), aby eliminovali -oxidaci
• nový kmen je schopen produkovat
-hydroxymastné kyseliny, které
lze použít pro výrobu bio-polymerů
(plastů podobných polyetylenům,
bio-odbouratelné na bio-palivo)
• další modifikace kmene
(integrace genů pro lipásy)
by umožnilo přímé odbourávání
odpadních olejů …
YAC (yeast artificial chromosome)
• Bakteriální část – Amp
resistence, počátek replikace
• Kvasinková část – marker, CENARS,
TEL
• 50-500kbp insert např. lidská
genová banka pro HuGO 80000
klonů YAC (270kbp)
• Klonování, množení, uchování
dlouhých fragmentů DNA
• Výzkum savčích telomer a
centromer
• Pomocí transfekce, lipofekce
nebo elektroporace lze dostat
YAC i do savčích buněk –
náhodně se integrují do genomu
- výzkum nesestřihnutých genů
(dlouhé regulační úseky)
Transformační protokol
• Exponenciální kultura
• Opláchnout vodou a TE/LiAc roztokem
• Rozsuspendovat v TE/LiAc roztoku a přidat DNA
(plasmidová/cirkulární i lineární DNA)
• Přidat TE/LiAc/PEG4000 roztok
• 30 minut na 30°C a poté teplotní šok při 42°C (15min)
• Stočit a pelet rozsuspendovat v TE roztoku
• Rozetřít na selektivní plotnu
Integrace I.
- integrativní plasmid pro P. pastoris
(GS1115, genotype: his4 )
- exprese z AOX1 promotoru
- integrace do AOX1 lokusu
- mechanismus homologní rekombinace
• Využití inhibitoru FOA pro „odléčení“ URA3 markeru (FOA je přeměňována
Ura3p dekarboxylázou na toxický 5-fluorouracil => URA3+ buňky nerostou,
zatímco ura3- buňky jsou rezistentní)
• Buňky se stávají ura-, takže URA3 marker lze využít několikrát
Integrace: disrupce/delece genu
- studium funkce genu – fenotyp (delece/mutace)
- esenciální gen => buňky potřebují gen např. na plasmidu
(plasmid shuffling)
- životaschopné – mutace lze přímo integrovat do genomu
- mutantní kmeny se testují na citlivost k různým „toxinům“ – dále je lze
křížit s funkčně podobnými geny-mutantami a hledat jejich funkční vztahy
(synthetic lethal x epistatic x suprese)
1. krok 2. krok
neesenciální gen
specifická mutace
Delece genu - PCR
• pro rekombinaci stačí pouze krátká homologie (50-100nt pro S.c.)
• místo integrativních plasmidů = oligonukleotidy ~ 70nt dlouhé postačí (při 2
krokové PCR se kromě dlouhé homologie vnesou ještě specifické sekvence pro
pozdější manipulace …)
kanMX
kanMX
kanMX
1.PCR (barcode)
2.PCR (homologie)
Kvasinkový ORF
- systematicky provedeno na >6000 genech v rámci projektu EuroFan
- kmeny lze získat z archivu EUROSCARF
http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html
Giaever et al, Nature, 2002
EuroFan projekt - testy fenotypu
Buněčná stěna
(stabilizující)
Oprava DNA
Mikrotubuly
(stabilizující)
ts
cs
- Systematicky provedeno na >6000 genech v rámci projektu EuroFan
- Funkční kategorie genů – anotace v databázích (genová ontologie)
Mikrotubuly
(destabilizující)
Bun. stěna
(destabilizující)
Winzeler et al, Science, 1999; Giaever et al, Nature, 2002
~ 6000 heterozygotních delečních kmenů
~ 5000 homozygotních delečních kmenů (+ ~ 1000 esenciálních genů)
(neesenciální – růst za specifických podmínek nebo redundantní procesy)
- Testováno ~400 malých molekul
a stresových podmínek (-aa ...)
- Celkem provedeno ~ 6milionů
testů
- multidrug resistance (MDR)
pokud byl gen potřebný pro
resistenci vůči >20% z
testovaných látek
- Podobné profily svědčí o funkční podobnosti
Hillenmeyer et al, Science, 2008
Geny/Proteiny peroxisomu
Cre rekombinasa – odstranění markeru
Postup lze použít několikrát se stále stejným
markerem
Nevýhoda pro genetické studie (marker
nekosegreguje s mutací)Guldener et al, NAR (1996)
Watsonetal,Gene,2008
diploid
K integraci u kvasinek není nutný CRISPR
- účinná homologní rekombinace
- CRISPR zvyšuje účinnost mnohonásobné
integrace (řízené štěpení DNA)Horwitz et al, Cell Syst, 2015
Cas9 zaintegrován
gRNA kazeta definuje
místo štěpení
donorová DNA nese
integrační insert
Integrace: inzerce genu (CRISPR-Cas9)
Horwitz et al, Cell Syst, 2015
Phosphoenol pyruvate (glykolýza)
6 integrací do 3 lokusů (po dvou)
syntéza kyseliny mukonové - bioplasty
AroY v pěti kopiích – zvýšilo výtěžek
delece ARO1 blokuje tvorbu aromatických AMK (dráha vede na kys. mukonovou) a nutí
buňky do této dráhy – v biotechnologickém procesu nejdříve na bohatém médiu roste
biomasa – poté se na minimálním médiu (bez aromatických AMK) spouští tato dráha
gRNA kazeta definuje
místo štěpení
donorová DNA nese
integrační insert
nová metabolická dráha
lokusy: GAL80, HO, ARO1
AroB, D, F, Y a Z = E. coli
CATA = C. albicans
Delece genu pomocí transposonů
Defekt buněčné stěny
MacDonald et al.: Nature, 1999
esenciální
Citlivé …
popsat
Micheletal,eLife,2017
SAturated Transposon Analysis in Yeast (SATAY)
- generováno 1.000.000 klonů – 300.000 inzercí (vysoké pokrytí na 6.000 genů)
- cirkulární DNA použita pro NGS sekvenování (MiniDs transposon-specifické primery)
- inzerce každých 40bp (preferenčně v nucleosom-free oblastech)
- každý transposon sekvenován 20x …
Michel et al, eLife, 2017
- inzerce chyběly v
esenciálních genech
(zelené šipky)
- charakterizace GO,
drug screening,
syntetická letalita, …
- rozlišení na úrovni
domén (GAL10 – dvě
domény z nichž
esenciální je pouze
první …)
- C-koncové, ale i Nkoncové
delece
Životní cyklus S. cerevisiae
- Deleci či mutaci lze provést v
haploidní či diploidní buňce
- v haploidní buňce hrozí suprese
defektu proto je lépe používat
diploidní buňky (druhá kopie zůstává
nezměněná)
- lze připravit dvojitého mutanta
křížením haploidních mutant a poté
sporulací diploida
- pouzdro spory je třeba rozrušit a
pomocí mikromanipulátoru získat
jednotlivé haploidní buňky (lze
provést i tzv. random sporulation)
- u S.pombe jsou diploidní buňky
nestálé a okamžitě sporulují
(pouzdro se rozpadá samo)
- Více v dalších přednáškách
Životní cyklus S. cerevisiae
- Deleci či mutaci lze provést v
haploidní či diploidní buňce
- v haploidní buňce hrozí suprese
defektu proto je lépe používat
diploidní buňky (druhá kopie zůstává
nezměněná)
- lze připravit dvojitého mutanta
křížením haploidních mutant a poté
sporulací diploida
- delece esenciálního genu lze provést pouze
v diploidní buňce (haploidní nepřežije)
- po iniciaci sporulace dojde k meiotickému
dělení (2n -> 4n -> 4x 1n) a vzniknou 4
haploidní buňky (lze rozdělit
mikromanipulátorem – tetrádová analýza)
Tetrádová analýza
(S. pombe)
spory přeneseny tenkou jehlou a
rozmístěny v pravidelných
odstupech
YPD
Tetrádová analýza
2 spory/kolonie normální
+
2 spory/kolonie mutantní
YPD
Selektivní médium (SD-ura ... testy)
AAaa
aaAA
AaAa
AaAa
.
.
.
Životní cyklus S. cerevisiae
- lze připravit dvojitého mutanta křížením
haploidních mutant a poté sporulací diploida
- frekvence typů závisí na vzájemné pozici
genů – různé chromosomy => nezávislá
segregace, stejný chromosom (Morganovy
zákony – čím blíže, tím méně cross-over)
Dvojité mutanty – funkční příbuznost
haploid x haploid => diploid – stejný fenotyp - identický gen
- bez fenotypu – díky wt alele (různé geny)
sporulace => haploid – stejný fenotyp – epistatický (funkčně příbuzné geny)
- aditivní až letální (paralelní dráha, redundance, rozpad
komplexu)
A
b
C
D
e
F
A
B E
A
b
c
D
E
F
Mutageneze pomocí hydroxylaminu … hledání (screening) letálního mutanta –
mutageneze kmene s vypínatelným plasmidem (promotor nebo FOA – viz
plasmid shuffling)
Epistatický Letální
D
C
F
Proteinový
komplex
Pomocí těchto genetických metod byly analyzovány metabolické dráhy …
proteinové komplexy …
Hledání funkčně příbuzných genů
Luetal.,JACS(2010)
alcohol
dehydrogenase
Fatty
alcohol
oxidase
P450
- delece homologních enzymů (např.
dehydrogenás) potlačí metabolické
schopnosti buňky (DP421 = méně
-hydroxymastné kyselin)
Příprava aneuploidních buněk
KAR1 gen potřebný pro
karyogamii tj. pro fuzi jader
a::HIS3 + a::kanMX =>
a::specifické promotory rezistence
pouze v (a)
haploidních buňkách
Studium vlivu aneuploidie na
buňku (u člověka se podílí na
kancerogenezi, aneuploidie v
90% lidských nádorů)
Torres et al, Science, 2007