Protoplasty kvasinek jako modelový objekt 1. Historie objevu modelu protoplastů 2. Metody přípravy protoplastů 3. Metody regenerace buněčné stěny u protoplastů 4. Fuze protoplastů 5. Genetická transformace kvasinek na modelu protoplastů 6. Sexuální hybridizace u protoplastů Cell wall lysis or mechanical rupture Plant cell 1. Historie objevu • Protoplasty rostlinných buněk (Klebs 1887,Townsend 1897) • Sféroplasty, L-formy a protoplasty bakterií (Weibull 1953, Dienes 1939, Kandler, 1954) • O.Nečas a plasmatické koule kvasinek (Nečas 1954) • Autolytické protoplasty (Nečas 1955) • Protoplasty připravené lýzou b. stěny helikázou (Eddy a Wiliamson,1959) • Regenerace protoplastů v gelech (Nečas, 1962, Svoboda 1966) 2.Metody přípravy protoplastů • Mechanické rozbití kvasinkových buněk v hypertonickém roztoku • Autolýza buněčné stěny • Aplikace enzymů lyzujících buněčnou stěnu – Výběr osmotika - sorbitol, mannitol, KCl, MgSO4 a koncentrace – Aplikace látek rušících S-S vazby v buněčné stěně – merkaptoetanol,dithiothreitol aj Buňky kvasinky Saccharomyces cerevisiae a čerstvě vytvořené protoplasty Trigonopsis variabilis Protoplasty S. cerevisiae ve fázovém kontrastu (3a) a po lýze v destilované vodě – pokovený preparát v elektronovém mikroskopu (3) Růst protoplastů v tekutém mediu nebo na povrchu agarových bločků: jádra se dělí, cytoplasma vytváří vakuolizované útvary, avšak cytokineze neprobíhá. Závěr: Protoplasty – buňky bez buněčné stěny - se nemohou reprodukovat Regenerace buněčné stěny na povrchu protoplastů při kultivaci Tvar rostoucího protoplastu je není určován regenerující buněčnou stěnou, ta jen modifikuje morfologii rozpínající se cytoplasmy v tekutém mediu v gelu Fibrilární síťovina na povrchu protoplastu rostoucího v tekutém mediu Regenerace protoplastů v želatinovém gelu Tvorba kompaktní buněčné stěny na povrchu protoplastů Povrch a řez kompaktní buněčnou stěnou Morfologie regenerace protoplastů v agarovém gelu První generace revertovaných buněk mají abnormální morfologii, která se postupně vrací k normě u dalších generací Regenerace protoplastů v polyethylenglykolovém mediu Protoplasty některých kvasinek mohou regenerovat na agarových filmech nebo i v tekutém mediu Aglutinace protoplastů ve 40% polyethylenglykolu a vytváření polyprotoplastů po zředění živným mediem Povrchy agregovaných protoplastů ve 40% PEG Lokální poruchy struktury plasmatické membrány po inkubaci protoplastů ve 40% PEG 30 min při 370 C Aplikace protoplastů kvasinek v buněčné biologii a genetice • 1. Studium funkce buněčné stěny mechanická bariéra signální funkce – recepce stresových faktorů, feromonů aj regenerační schopnosti buňky syntéza komponent buněčné stěny • 2. Studium struktury plasmatické membrány • 3. Studium nepohlavní hybridizace kvasinek cestou fůze protoplastů • 4. Transformace kvasinek izolovanou DNA Protoplasty S.c. α + a, pouze neorientovaný růst, žádná fuze α protoplasty + a buňky: párovací výběžky tvoří pouze buňky Orientovaný růst buněk směrem k rostoucímu protoplastu – žádná fuze Protoplasty S.c. α + a, pouze neorientovaný růst, žádná fuze α protoplasty + a buňky: párovací výběžky tvoří pouze buňky Orientovaný růst buněk směrem k rostoucímu protoplastu – žádná fuze Orientovaný růst buněk směrem k rostoucímu protoplastu – žádná fuze Protoplasty opačných párovacích typů fúzují teprve tehdy, zregenerují-li svoji buněčnou stěnu Mezidruhová fuze S.cerevisiae his- x S.pombe trp- :tyto druhy jsou fylogeneticky vzdálené, S. cerevisiae má 16 chromosomů, S. pombe pouze 3. Protoplasty mohou fúzovat, v minimálním agaru i rostou, na hybridní buňky však nerevertují