Sekreční dráha a endocytóza
(vesikulární transport)
v kvasinkové buňce
Transport látek v buňce:
transport malých molekul (ionty, aminokyseliny, monosacharidy)
difuze (v cytoplasmě)
molekulární přenašeče (přes membránu)
transport makromolekul (glykoproteiny)
vesikulární transport (sekreční a endocytické váčky)
Metabolické dráhy: exocytóza (sekrece)
endocytóza
Schéma sekrece a endocytózy v živočišné buňce
Jak je kontrolován postup sekrečního produktu
po sekreční dráze ER---GA---SV?
Sekretované makromolekuly (glykoproteiny) jsou v buňce
uzavřeny v membránových organelách – organelách
sekreční drány - endoplasmatického retikula (ER),
Golgiho aparátu (GA) a sekrečních váčků (SV).
Hypotéza:
jednosměrná dráha sekrečního produktu by mohla být
řízena interakcí proteinů, které jsou na povrchu membrán
organel sekreční dráhy – ER, GA, SV.
Model: kvasinková buňka:
- je eukaryotická, má rychlý metabolizmus, reprodukuje se rychle, snadno se dají
získat mutace většiny genů. Měla by mít rovněž sekreční organely, neboť
Kvasinková buňka
sekretuje:
glykoproteiny do buněčné stěny pupene
glykoproteiny do periplasmatického
prostoru (mezi buněčnou stěnou a
plasmatickou membránou)
endocytózou přijímá
nadbytečný membránovýmateriál z pupene
V kvasinkové buňce jsou organely sekreční dráhy málo zřetelné, cisteren ER je
relativně málo, sekreční vesikly jsou někdy vidět v pupenu, Golgiho cisterny nejsou
přítomny.
U kvasinek S. cerevisiae byly
detekovány geny, jejichž produkty
jsou potřebné pro průběh sekrece
a endocytózy.
Mutací těchto genů je sekreční
dráha resp. endocytóza
blokována v místě, kde schází
genový produkt.
Mutanty genů sekreční dráhy (sec
mutanty) izoloval R. Schekman
Randy Schekman
(Nobelova cena 2013)
Jak se izolují sec mutanty?
Jestliže syntéza bílkovin pokračuje, ale sekrece je zastavena, vzrůstá specifická
hmotnost buněk a v hustotním gradientu jsou těžší.
Z frakce těžších buněk se případně izolují teplotně senzitivní mutanty: v pokojové
teplotě 250C probíhá sekrece proteinů normálně, avšak při zvýšení kultivační teploty
na 370C je sekrece zastavena na tom místě, kde schází teplotě denaturovaný
protein.
Sekreční mutanta S. cerevisiae
sec 18, transfer 25 0C do 37 0C
240C 370C
V kvasinkové buňce je relativně malé množství sekrečních organel, neboť proces
sekrece je rychlý – během 90 min je třeba nasyntetizovat kompletní novou
buněčnou stěnu. Chybí-li však některý z regulačních proteinům proces sekrece se
na určitém místě zastaví a nahromadí se poslední funkční organela.
Sekreční mutanta S. cerevisiae
sec 7
Transfer z 25 0C do 37 0C
240C 370C
Sekreční mutanty kvasinek:
ts sec 1, 24 oC → 37 oC
370C 240C
Jaký význam má pasáž přes sekreční
kompartmenty?
Kvasinky secernují mannanproteiny, které se ukládají ve stěně. Ty
mají funkci strukturální nebo katalytickou (např. invertáza MV 270
000, z toho 55% je mannan
Při izolaci ER ze sec 18 byla zjištěna invertáza s malým obsahem
mannanu.
Při izolaci GA ze sec 7 zjištěna invertáza plně glykosylována.
Proteinová část invertázy je tedy syntetizována v ER, kde je i
částečně glykosylována. Glykosylace tohoto glykoproteinu je
dokončena v GA.
Proteiny, potřebné k exocytóze sekrečního váčku (postGolgi
secretory vesicle), definované na základě genetické
analýzy sekrečních mutant
Exocytosa
Molekulární
mechanizmy fuze
membrány
sekrečního váčku s
plasmatickou
membránou:
interakce
membránových
proteinů startuje
fuzi membrány
Endocytóza
Jak lze sledovat postup přijímaných molekul
endocytózou:
- radioaktivní polypeptid n. polysacharid
- ferritin (na ultratenkých řezech)
- FITTC - fluorescencí zabarvený substrát
(luciferáza) se objeví nejprve ve frakci
měchýřků - endosomy, pak ve frakci
lyzosomů
Endocytóza: invaginace plasmatické
membrány. Tvorba a odštěpení váčku -
endosomu
Analýza participace genů (genových produktů) na
endocytóze u S. cerevisiae (Drubin)
actin
Současný model molekulárního
mechanizmu endocytózy:
Las17 (WAS) a Myo1 aktivují protein
2/3(Arp2/3). Tento komplex aktivuje
polymerizaci aktinu, kde hrají úlohu
ještě další proteiny. Současně se
organizuje clathrinový obal
měchýřku. Polymerizace aktinu vede
k prohlubování invaginace
plasmatické membrány a oddělení
měchýřku – endosomu.
Molekulární mechanismy vzniku hereditární
hypercholesterolemie
1. Porucha syntézy
receptorového proteinu na
ER
2. Porucha postranslační
modifikace proteinu v GA
3. Porucha vazby
receptorového proteinu s
ligandou (LDL – light density
lipoproteins)
4. Porucha shlukování
komplexu receptor-LDL v
plasmatické membráně