CG020 Genomika Přednáška 2 – dokončení Identifikace genů Jan Hejátko Funkční genomika a proteomika rostlin, Mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin, Středoevropský technologický institut (CEITEC), Masarykova univerzita, Brno hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.muni.cz  Identifikace genů ab initio  příprava genově obohacených knihoven pomocí technologie metylačního filtrování  EST knihovny  přímá a reverzní genetika  Experimentální identifikace genů  genomová kolinearita a genová homologie  struktura genů a jejich vyhledávání  Postupy „přímé“ a reverzní genetiky  rozdíly v myšlenkových přístupech k identifikaci genů a jejich funkcí Osnova (dokončení přednášky 02)  Změna fenotypu po mutagenezi  Genetika přímá  Identifikace sekvenčně-specifického mutanta a analýza jeho fenotypu  Genetika reverzní  Analýza exprese daného genu a jeho časoprostorové specifity  Principy experimentální identifikace genů prostřednictvím přímé a reverzní genetiky Přímá a reverzní genetika  Změna fenotypu po mutagenezi  Genetika přímá  Principy experimentální identifikace genů prostřednictvím přímé a reverzní genetiky Přímá a reverzní genetika  CKI1 overexpression mimics cytokinin response Kakimoto, Science, 1996 NO hormones tZ ctrl1 ctrl2Plasmid Rescue Pro35S::CK1 Identifikace CKI1 aktivační mutagenezí Hormonal regulations of plant development Signal Transduction via MSP NUCLEUS CYTOKININ PM AHK sensor histidine kinases • AHK2 • AHK3 • CRE1/AHK4/WOL REGULATION OF TRANSCRIPTION INTERACTION WITH EFFECTOR PROTEINS HPt Proteins • AHP1-6 Response Regulators • ARR1-24 Hormonal regulations of plant development  Změna fenotypu po mutagenezi  Genetika přímá  Identifikace inzerčního mutanta a analýza jeho fenotypu  Genetika reverzní  Principy experimentální identifikace genů prostřednictvím přímé a reverzní genetiky Přímá a reverzní genetika Hormonal regulations of plant development Identification of insertional cki1 mutant allele Hormonal regulations of plant development CKI1 Regulates Female Gametophyte Development CKI1/CKI1CKI1/cki1-i Hejátko et al., Mol Genet Genomics (2003) Hormonal regulations of plant development A. ♂ wt x ♀ CKI1/cki1-i B. ♂ CKI1/cki1-i x ♀ wt C. ♂ wt x ♀ CKI1/cki1-i D. ♂ CKI1/cki1-i x ♀ wt CKI1 specific primers (PCR positive control) cki1-i specific primers CKI1 and Megagametogenesis  cki1-i is not transmitted through the female gametophyte Hormonal regulations of plant development FG 0FG 1FG 2FG 3FG 4 CKI1 and Megagametogenesis Hormonal regulations of plant development cki1-iCKI1 late FG5FG6FG7 24 HAE48 HAE CKI1 and Megagametogenesis Hejátko et al., Mol Genet Genomics (2003) Hormonal regulations of plant development  Změna fenotypu po mutagenezi  Genetika přímá  Identifikace inzerčního mutanta a analýza jeho fenotypu  Genetika reverzní  Analýza exprese daného genu a jeho časoprostorové specifity  Principy experimentální identifikace genů prostřednictvím přímé a reverzní genetiky Přímá a reverzní genetika Hormonal regulations of plant development CKI1 is Expressed During Megagametogenesis FG0-FG1 FG3-FG4 FG4-FG5 FG7 Hormonal regulations of plant development 12 HAP (hours after pollination) 24 HAP48 HAP72 HAP ♀ wt x ♂ ProCKI1:GUS Paternal CKI1 is Expressed in the Arabidopsis Sporophyte Early after Fertilization 24 HAP Hejátko et al., Mol Genet Genomics (2003) Hormonal regulations of plant development CG020 Genomika Přednáška 3 Reverzní genetika Jan Hejátko Funkční genomika a proteomika rostlin, Mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin, Středoevropský technologický institut (CEITEC), Masarykova univerzita, Brno hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.muni.cz  Zdrojová literatura  Bioinformatics and Functional Genomics, 2009, Jonathan Pevsner, WilleyBlackwell, Hobocken, New Jersey http://www.bioinfbook.org/index.php  Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, New Jersey  Mello, C.C. and Conte Jr., D. (2004) Revealing the world of RNA interference. Nature, 431, 338-342.  Klinakis et al.. (2000) Genome-wide insertional mutagenesis in human cells by the Drosophila mobile element Minos. EMBO Rep, 1, 416.  Hansen et al.. (2003) A large-scale, gene-driven mutagenesis approach for the functional analysis of the mouse genome. PNAS, 100, 9918. Genomika 03 „Přímě genetický“přístup 1. IDENTIFIKACE FENOTYPU 2. GENETICKÉ MAPOVÁNÍ 3. GENOVÁ IDENTIFIKACE -poziční klonování „Reverzně genetický“ přístup 1.IZOLACE SEKVENČNĚ SPECIFICKÉHO MUTANTA 2. IDENTIFIKACE FENOTYPU 3. PRŮKAZ KAUZÁLNÍ SOUVISLOSTI MEZI INZERCÍ A FENOTYPEM NÁHODNÁ MUTAGENEZE Přístupy „klasické“genetiky versus „reverzně genetický“ přístup ve funkční genomice EMS T-DNA (retro)transposons  Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi fenotypem a inzerční mutací  využití nestabilních inzerčních mutagenů a izolace revertantních linií  kosegregační analýza  Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů  příprava sbírky mutantů  vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR  vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v elektronických databázích  identifikace nezávislé inzerční alely Osnova  vypínání genů (knocking-out) pomocí homologní rekombinace  komplementace mutanta pomocí transgenu  Umlčování genů pomocí RNA interference  Mechanismus RNAi Osnova  Editace genomu pomocí CRISPR/Cas9 • Mobilní elementy • Stabilní elementy  Autonomní transpozony (En-1)  Neautonomní transpozony (dSpm)  T-DNA  obsahují gen pro transponázu, umožňující excizi a opětovné začlenění do genomu  na obou koncích obsahují krátké obrácené repetice, které jsou transponázou rozpoznávány  mutant En/Spm transpozonu, který mutací v genu pro transponázu ztratil autonomii  může být aktivován křížením s linií nesoucí En/Spm transpozon  zcela stabilní, její inzerce však může vést k chromozomovým přestavbám (inverze, delece, transpozice) Typy inzerčních mutagenů vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR Knihovny inzerčních mutantů (u rostlin) příprava transgenních rostlin vytvoření populace mutantních jedinců Knihovny inzerčních mutantů (u živočichů) Transfekce do lidských buněčných kultur (HeLa) nebo myších embryonálních kmenových (ES) buněk vytvoření populace mutantních buněčných linií a analýza frekvence inzercí In vitro analýzy nebo příprava knihovny inzerčních mutantů reintrogresí ES do myších embryí  Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů  příprava sbírky mutantů  vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR Osnova  „trojrozměrné“ vyhledávání pomocí PCR Izolace sekvenčně specifických mutantů 1.Knihovna En-1 inzerčních mutantů • 3000 nezávislých linií • průměrně 5 kopií na linii • trojrozměrné vyhledáváni pomocí PCR • autonomní En/Spm, bez selekce Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky  „Trojrozměrné“ vyhledávání pomocí PCR  izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace a vytvoření souhrnných souborů DNA („trojice“, řady a sloupce trojic a jednotlivé podnosy) p o o l 1 ......p o o l 2 8 28x3-tray pools 90 R 28 x 7 row pools 28 x 5 column pools 35 B 35 B 28 x 3 1-tray pools 3.000 mutantních linií A.t. (5 kopií En-1/linii) Izolace sekvenčně specifických mutantů Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky  „Trojrozměrné“ vyhledávání pomocí PCR  izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace a vytvoření souhrnných souborů DNA („trojice“, řady a sloupce trojic a jednotlivé podnosy)  identifikace pozitivní „trojice“ pomocí PCR, blotování PCR produktů a hybridizace s genově specifickou sondou Izolace sekvenčně specifických mutantů Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky p o o l 1 ......p o o l 2 8 28x3-tray pools Identifikace PCR produktu pomocí hybridizace s genově spec. sondou 1. Vyhledávání pozitivní trojice En-1 En-8130 En-205 Xho67 1262 CKI1 CKI1 En-1 En-8130 En-205Xho67 1262 CKI1 CKI1 (2x2x28=112 PCR reakcí) 3.000 mutantních linií A.t. (5 kopií En-1/linii) Izolace sekvenčně specifických mutantů Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky  „Trojrozměrné“ vyhledávání pomocí PCR  izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace a vytvoření souhrnných souborů DNA („trojice“, řady a sloupce trojic a jednotlivé podnosy)  identifikace pozitivní „trojice“ pomocí PCR, blotování PCR produktů a hybridizace s genově specifickou sondou  identifikace pozitivní linie pomocí Identifikace pozitivního „tácu“, řady a sloupce Izolace sekvenčně specifických mutantů Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky p o o l 1 ......p o o l 2 8 28x3-tray pools Identifikace PCR produktu pomocí hybridizace s genově spec. sondou 1. Vyhledávání pozitivní trojice 2. Identifikace linie nesoucí inzerci En-1 En-8130 En-205 Xho67 1262 CKI1 CKI1 En-1 En-8130 En-205Xho67 1262 CKI1 CKI1 (2x2x28=112 PCR reakcí) (dalších 5+7+3=15 PCR reakcí) Celkem 112+15=127 PCR reakcí 9 0 R 7 row pools 5 column pools 3 5 B 3 5 B 3 x 1-tray pools 3.000 mutantních linií A.t. (5 kopií En-1/linii) Izolace sekvenčně specifických mutantů  Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů  příprava sbírky mutantů  vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR Osnova  „trojrozměrné“ vyhledávání pomocí PCR  hybridizace s produkty iPCR na filtrech Inzerční knihovna dSpm mutantů  48.000 linií  neautonomní transposon  SINS (sequenced insertion sites) databáze  PCR vyhledávání nebo hybridizace s iPCR filtry  The Sainsbury Laboratory (SLAT-lines), John Innes Centre, Norwich Research Park  DNA a semena v Nottingham Seed Stock Centre http://nasc.nott.ac.uk  průměrně 1.2 izerce na linii Izolace sekvenčně specifických mutantů T-DNA  Hybridizace s produkty iPCR na filtrech  izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace  štěpení restriční endonukleázou  ligace, vznik cirkulární DNA  inverzní PCR (iPCR) pomocí T-DNA specifických primerů  příprava nylonových filtrů s produlty iPCR v přesně daném vzorci (poloze) pomocí robota  hybridizace s genově specifickou sondou Izolace sekvenčně specifických mutantů  Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů  příprava sbírky mutantů  vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR  vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v elektronických databázích Osnova Příprava knihoven z populace A. thaliana mutované pomocí T-DNA GABI-Kat (MPIZ, Köln) Izolace sekvenčně specifických mutantů Vyhledávání v elektronických knihovnách inzerčních mutantů Vyhledávání v elektronických knihovnách inzerčních mutantů | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gtgactaaagtgtaattaataagtga……… 1923 13  Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů  příprava sbírky mutantů  vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR  vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v elektronických databázích Osnova  vypínání genů (knocking-out) pomocí homologní rekombinace Knocking-Out the Gene  Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi fenotypem a inzerční mutací  využití nestabilních inzerčních mutagenů a izolace revertantních linií  kosegregační analýza  Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů  příprava sbírky mutantů  vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR  vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v elektronických databázích  identifikace nezávislé inzerční alely Osnova  vypínání genů (knocking-out) pomocí homologní rekombinace  komplementace mutanta pomocí transgenu  přítomnost více inzercí v jedné linii Proč je nutné analyzovat příčinnou souvislost mezi inzercí a pozorovaným fenotypem ?  možnost vzniku nezávislé bodové mutace  s inzercí T-DNA jsou často asociovány chromozomové aberace a přestavby (duplikace, inverze, delece)  Kosegregační analýza  kosegregace specifického fragmentu např. po inzerci T-DNA (nebo působení EMS atd.) do genomu s pozorovaným fenotypem cki1::En-1 + ++ + + + + + ++ Kauzalita mezi inzercí a fenotypem  excize transpozonů není vždy zcela přesná-vznik bodových mutací - izolace revertantních linií s tichou mutací i stabilních mutantů Využití autonomních transpozonů pro izolaci nových stabilních mutací a revertantních linií  transpozony se často vyznačují excizí a reinzercí do blízké oblasti-využití při izolaci nových mutantních alel Fenotyp šešulí cki1::En-1/CKI1 cki1::En-1/CKI1 CKI1/CKI1 1. Izolace revertantních linií • PCR vyhledávání ve 246 rostlinách segregující populace • z 90 cki1::En-1 pozitivních 9 rostlin mělo kromě šešulí mutantních i šešule standardního typu Analýza potomstva • potvrzení absence inzerce pomocí PCR • PCR amplifikace a klonování části genomové DNA v místě inzerce • sekvenování Potvrzení fenotypu cki1::En-1/CKI1 Využití autonomních transpozonů pro izolaci nových stabilních mutací a revertantních linií 2. Izolace stabilní mutantní linie • analýza fenotypu segregující populace (CKI1/CKI1 CKI1/cki1::En-1) • PCR analýza rostlin s mutantním fenotypem-identifikace rostlin bez inzerce • PCR amplifikace a klonování části genomové DNA v místě inzerce • sekvenování Potvrzení fenotypu cki1::En-1/CKI1 Využití autonomních transpozonů pro izolaci nových stabilních mutací a revertantních linií Komplementace mutantní linie Transposone/T‐DNA GOI GO I Ranjan et al., 2014 Komplementace mutantní linie  Umlčování genů pomocí RNA interference  Mechanismus RNAi Osnova  Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS)  RNAi objevena u rostlin a Coenorhabditis elegans  umlčování bylo indukováno jak sense tak antisense RNA (pravď. kontaminace obou při in vitro transkripci)  dsRNA indukovala umlčování cca 10-100x účinněji RNA interference Waterhaus et al., PNAS (1998)  Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS)  dsRNA indukce je závislá na vlastních genech - gen. vyhledávání RNA interference RNAi rnai Mello and Conte, Nature (2004)  Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS)  RNAi objevena u Coenorhabditis elegans a u rostlin  je to přirozený mechanismus regulace genové exprese u všech eukaryot  podstatou je tvorba dsRNA, která může být spuštěna několika způsoby:  přítomnost cizí „aberantní“ DNA  specifické transgeny obsahující obrácené repetice částí cDNA  transkripce vlastních genů pro shRNA (short hairpin RNA) nebo miRNA (micro RNA, endogenní „vlásenková“ RNA)  dsRNA je procesována enzymovým komplexem (DICER), což vede k tvorbě siRNA (short interference RNA), která se pak váže buď na enzymový komplex RITS (RNA-induced transcriptional silencing complex) nebo RISC (RNA-induced silencing komplex)  RISC zprostředkovává buď degradaci mRNA (v případě úplné similarity siRNA a cílové mRNA) nebo vede pouze k zastavení translace (v případě neúplné homologie jako je tomu např. v případě miRNA  RITS zprostředkovává reorganizaci genomové DNA (tvorba heterochromatinu a inhibice transkripce) RNA interference RNA-dependent RNA polymerase short hairpin RNA micro RNA Mechanism of RNA interference + tasiRNAs 21-25 bp Mello and Conte, Nature (2004) From MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.., Adams, P.D., and Doudna, J.A. (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: 195 -198. Reprinted with permission from AAAS. Photo credit: Heidi Dicer and Dicer-like proteins Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: EMBO J. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998) AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J. 17: 170–180. Copyright 1998; Reprinted from Song, J.-J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor, L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: 1434 – 1437. with permission of AAAS. Argonauta argo argonaut pelagickýago1 Argonaute proteins MIR gene RNA Pol AAAn AGO AAAn RNA Pol mRNA AGO AGO RNA Pol AGO AGO AAAn siRNA miRNA post-transcriptional gene silencingtranscriptional gene silencing transcriptional slicing translational repression binding to DNA binding to specific transcripts The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 Andrew Z. Fire Craig C. Mello USA USA Stanford University School of Medicine Stanford, CA, USA University of Massachusetts Medical School Worcester, MA, USA b. 1959 b. 1960  Umlčování genů pomocí RNA interference  Mechanismus RNAi Osnova  Editace genomu pomocí CRISPR/Cas9  Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR/Cas9 - Mechanism Jiang and Doudna, Cell (2017) trans-activating CRISPR RNA CRISPR-associated (Cas) genes CRISPR RNA 20 bp of guide sequence preceding the Protospacer Adjacent Motif CRISPR/Cas9 – Genome Editing Jiang and Doudna, Cell (2017) CRISPR/Cas9 – Nobel Prize in 20..2x? Francisco Mojica Emmanuelle Charpentier Jenifer Doudna Martin Jinek Jinek et al, Science (2012)  Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi fenotypem a inzerční mutací  využití nestabilních inzerčních mutagenů a izolace revertantních linií  kosegregační analýza  Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů  příprava sbírky mutantů  vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR  vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v elektronických databázích  identifikace nezávislé inzerční alely Shrnutí  vypínání genů (knocking-out) pomocí homologní rekombinace  komplementace mutanta pomocí transgenu  Umlčování genů pomocí RNA interference  Mechanismus RNAi Shrnutí  Editace genomu pomocí CRISPR/Cas9 Diskuse