CG020 Genomika
Přednáška 6
Proteinové interakce v genových regulacích
Jan Hejátko
Funkční genomika a proteomika rostlin,
Mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin,
Středoevropský technologický institut (CEITEC), Masarykova univerzita, Brno
hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.muni.cz
 Zdrojová literatura
 Wilt, F.H., and Hake, S. (2004). Principles of Developmental Biology. (New York ;
London: W. W. Norton).
 Ainger, K., Avossa, D., Morgan, F., Hill, S.J., Barry, C., Barbarese, E., and Carson, J.H.
(1993). Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected
into oligodendrocytes. J Cell Biol 123, 431-441.
 Alberts, B. (1998). The cell as a collection of protein machines: preparing the next
generation of molecular biologists. Cell 92, 291-294.
 Grefen, C., Stadele, K., Ruzicka, K., Obrdlik, P., Harter, K., and Horak, J. (2008).
Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene
receptor family members. Molecular Plant 1, 308-320.
 Hu, C.D., and Kerppola, T.K. (2003). Simultaneous visualization of multiple protein
interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat.
Biotechnol. 21, 539-545.
 Shahbabian, K., and Chartrand, P. (2012). Control of cytoplasmic mRNA localization.
Cellular and molecular life sciences : CMLS 69, 535-552.
 Van Leene, J., Witters, E., Inze, D., and De Jaeger, G. (2008). Boosting tandem affinity
purification of plant protein complexes. Trends Plant Sci 13, 517-520.
 Walter, M., Chaban, C., Schutze, K., Batistic, O., Weckermann, K., Nake, C., Blazevic, D.,
Grefen, C., Schumacher, K., Oecking, C., Harter, K., and Kudla, J. (2004). Visualization of
protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.
Plant J 40, 428-438.
Genomika 06
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
 Analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA)
 Praktické využití metod pro studium PI in vivo
Osnova
 Funkční význam specifických interakcí proteinů
 Většina proteinů v buňce existuje ve
formě komplexů, které mohou dále
navzájem interagovat
 Proteazom
 proteinový komplex zodpovědný za
degradaci nepotřebných proteinů v
buňce
Význam interakcí
proteinů
1fnt
Proteazom
 Skládá se z centrálního komplexu
označovaného jako 20S a regulačních
částí (19S, někdy také 11S)
 Umožňuje cílenou degradaci proteinů
označených specifickou značkou, malým
proteinem (76 aa) - ubiquitinem
Význam interakcí
proteinů
Proteasome –řízená proteolýza
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
Význam PI
Regulation by histone
acetyl transferases or
histone deacteylases
CpG or CpNpG
CpNpNp
CpG
DNA methylation in animals vs. in plants
methylation status methylation status
Cell-specific methylation allows maintain of
tissue-specific gene expression profiles
Mechanism of transcriptional regulation by
DNA methylation mostly unknownImprinting and “cell memory”
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
Význam PI
Iniciace Transkripce
Positive TFs
Negative TFs
Iniciace Transkripce
Signal recognition
Dimerization
DNA binding
and
transcription
activation every 7th aa
Transcriční regulace
prostřednictvím TAFs
ProENDO16:REPORTER (sea urchin)
Deletion
mutagenesis Positive, interaction with
TAFs
Upregulation in the
presence of A and B
Developmental specificity
Combinatorial control
Midgut
Primary or skeletogenic
mesenchyme cells
Vegetal plate
Multifaktoriání kontrola promotorů
Regulation of β-globin type of
hemoglobin chains expression
Locus control region
Development-dependent
activation by LCR
•Acetylation of H3?
•Involvement of other
genes?
Cca 50 kbp
Multifaktoriání kontrola promotorů
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
Význam PI
BICOID mRNA NANOS mRNA
 Význam lokalizace mRNA
 Lokalizace proteinového produktu
genu v čase a místě
 asymetrické dělení během
vývoje
 polarizace embrya
Lokalizace mRNA
Shahbabian and Chartrand, 2012
ASH1 mRNA
 Role lokalizace mRNA
 Omezení exprese potenciálně
toxických proteinů
 lokalizace exprese
mRNA pro MYELIN
BASIC PROTEIN (MBP)
do oblasti myelinizace
nervových buněk
Lokalizace mRNA
Ainger et al., 1993
MBP mRNA
Shahbabian and Chartrand, 2012
 Difůze a ukotvení mRNA
 Během ranné oogeneze u drápatky je
Xcat-2 mRNA lokalizována do tzv.
mitochondriálního oblaku (MO,
Balbianiho tělísko)
 Pohyb MO je částečně závislý na
depolymerizaci mikrotubulů (tzv.
molekulární motor)
 Ukotvení na vegetálním pólu je dáno
interakcíá MO s ER
Lokalizace mRNA
Mechanizmy
 Lokalizovaná degradace mRNA
 V embryogenezi u Drosophila m.
dochází k polární lokalizaci Hsp83
mRNA, podobně jako NANOS
mRNA
 Hsp83 mRNA je lokalizována v
celém embryu, zde je však
destabilizována prostřednictvím cis
elementů jak v 3’UTR (HDE), tak v
kódující oblasti (HIE)
Lokalizace mRNA
Mechanizmy
 HIE elementy jsou rozpoznávány proteinem SMAUG, který
zprostředkováva vazbu degradačního komplexu
CCR4/POP2/NOT
 V oblasti posteriorního pólu je Hsp83 mRNA chráněna před
účinkem SMAUG tzv. HPE elementem v 3’UTR; mechanismus
této ochrany je dosud neznámý
Shahbabian and Chartrand, 2012
Shahbabian and Chartrand, 2012
 Aktivní transport mRNA
 Asymmetric Synthesis of HO1
(ASH1) je represor HO u S.
cereviseae; inhibice HO
endonukleázy v dceřinných buňkách
zabraňuje změně párovacího typu
 ASH1 mRNA je aktivně
transportována prostřednictvím
„molekulárních motorů“
asociovaných s aktinem
Lokalizace mRNA
Mechanizmy
 ASH1 mRNA obsahuje 4 cis
elementy (3 v CDS a 1 ve
3’UTR), které jsou
rozpoznávány RNA vazebným
proteinem SHE2
 SHE2 umožňuje
prostřednictvím SHE3 vazbu
na „molekulární motor“,
MYO4, který se váže na aktin
a umožňuje transport ASH1
mRNA do dceřinné buňky
Shahbabian and Chartrand, 2012
ASH1 mRNA
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Sestřih hnRNA
Význam PI
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Sestřih hnRNA
 Stabilita proteinů
Význam PI
Jing and Strader, Plant Structural Biology, Hormonal Regulations (2018)
Auxinová signalizace
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Sestřih hnRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
Význam PI
 PI a přenos signálu
 prostřednictvím G proteinu a
fosfolipasy C
 Signální kaskády využívající cAMP
PI a přenos signálu
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
Osnova
PI in vivo
Koimunoprecipitace
 založena na izolaci proteinových komplexů
pomocí protilátek rozpoznávajících jeden z
interagujících proteinů
CKI1
MYC
CKI1
HA
αMYC
αHA
CKI1
MYC
AHK3
HA
αMYC
CKI1-MYC
CKI1-HA
AHK3/4-HA
CKI1-HA
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
Osnova
PI in vivo
Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 izolace proteinových komplexů pomocí
rekombinantních proteinů, fúzovaných s dvěma
různými vazebnými doménami
 proteiny izolovaných komplexů jsou po rozdělení
na 1D ELFO identifikovány pomocí MS
 calmodulin-binding protein (CBP)
 IgG vázající domény proteinu A (ProtA)
 místo rozpoznávané specifickou
proteázou z TEV viru (tobacco etch
virus)
POI
 výhodou je použití dvou nezávislých proteinových
domén pro afinitiní purifikaci a tedy velká
specificita
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
Osnova
PI in vivo
Dvouhybridní kvasinkový test (Y2H)
 izolace proteinových komplexů pomocí
rekombinantních proteinů, každý z nich fúzovaný s
částí transkripčního faktoru Gal4
 jeden z proteinů (návnada, bait)
fúzovaný s DNA vazebnou doménou
Gal4 (Gal4-BD)
 druhý z proteinů (kořist, prey) fúzovaný
s aktivační doménou Gal4 (Gal4-AD)
 Interakce proteinů umožní rekonstituci vazebné
domény s aktivační doménou a spuštění
reportérového genu
 vizuální detekce (modré zbarvení, LacZ)
 auxotrofní selekce (růst na médiu bez
histidinu, His)
 umožňuje vyhledávání interakčních partnerů v
expresních knihovnách jednotlivých organismů
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
Osnova
 Proteinová interakce je detekována na
základě reasociace fluoreskujícího proteinu
 každý z potenciálních interakčních
partnerů je fúzován s jednou z
podjednotek fluoreskujícího
proteinu, např. YFP
 při interakci dojde ke
znovuobnovení fluorescence
 Kromě identifikace vlastní interakce
umožňuje i lokalizovat interakci v buňce
PI in vivo
bimolekulární fluorescenční
komplementace (BiFC)
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
 Analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA)
Osnova
PI in vivo
Analýza zprostředkované membránové
vazby (MeRA)
 Umožňuje identifikaci interakcí cytoplazmatických
proteinů s membránovými proteiny
 membránový protein je fúzován s
fluoreskujícím proteinem
 potenciální ineterakční partner je
fúzován s jimým fluoreskujícím
proteinem, lišícím se svým emisním
spektrem
 v případě interakce dojde ke změně
lokalizace cytoplazmatického proteinu
na membránu (kolokalizaci s
membránovým proteinem)

PI in vivo
Analýza zprostředkované membránové
vazby (MeRA)
GFP
GFPGFPGFP
P35S::ERS1:RFP + P35S::ΔTM-ETR2:GFP
PI in vivo
Analýza zprostředkované membránové
vazby (MeRA)
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
 Analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA)
 Praktické využití metod pro studium PI in vivo
Osnova
D’Agostino et al., Plant Phys, 2000
Signal Transduction via MSP
NUCLEUS
CYTOKININ
PM
AHK sensor histidine kinases
• AHK2
• AHK3
• CRE1/AHK4/WOL
REGULATION OF TRANSCRIPTION
INTERACTION WITH EFFECTOR PROTEINS
HPt Proteins
• AHP1-6
Response Regulators
• ARR1-24
CK primary response genes
- Type-A ARRs expression
Recent Model of the CK Signaling via Multistep Phosphorelay (MSP)
Pathway
AHP1
AtHK1
AHP2
AHP3
AHP4
AHP5
AHK2
AHK3
AHK4
CKI1
CKI2
ETR1
ETR2/EIN4
Is there any specificity in plant
MSP?
□ Is there a signalling specificity of MSP in plants?
Specificity of CKI1 signalling
□ CKI1 interacts in vivo with only subset of AHPs
BiFC Y2H
AHP1
AHP2
AHP3
AHP4
AHP5
AHP6
CKI1 CKI1RD
Pekárová et al., Plant Journal (2011)
CYTOKININ
Specificity of CKI1 Signalling
□ Specificity of CKI1 interaction was confirmed in vitro
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 50 100 150 200 250
AHP concentration [nM]
A450
AHP2 AHP3 AHP5
AHP3: Kd ~ 10,5 nM
AHP2: Kd ~ 9,17 nM
AHP5: Kd ~ 108 nM
Pekárová et al., Plant Journal (2011)
Structure of CKI1RD
□ X-ray crystallography revealed conserved (α/β)5 structural fold
of CKI1RD
Pekárová et al., Plant Journal (2011)
Dynamics of CKI1RD
□ Mg2+binding leads to remodelling of active centre of
CKI1RD
Pekárová et al., Plant Journal (2011)
CKI1RD structural changes are
associated with its binding specificity
□ Mg2+- and BeF3
--induced structural changes fine-tune
binding specificity of CKI1RD
Pekárová et al., Plant Journal (2011)
AHP1
AtHK1
AHP2
AHP3
AHP4
AHP5
AHK2
AHK3
AHK4
CKI1
CKI2
ETR1
ETR2/EIN4
Model Suggestion
□ YES, there is signalling specificity of MSP in plants.
P
P
P
P
P
P
P
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
 Analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA)
 Praktické využití metod pro studium PI in vivo
Shrnutí
Diskuse