Experimentální a aplikovaná toxikologie a ekotoxikologie– hodnocení křivek dávka-odpověď Jiří Novák Závislost dávka-odpověd •Na řadě úrovní •Molekulární úroveň (receptory, kanály,…) •Organismální (odpověď ano/ne, kontinuální škála) •Populační • http://uploads.webflow.com/5318f33ba240be9d1000000f/532c6f5119388d646e00006a_Patch%20Clamp%20pic.pn g http://o.quizlet.com/HXkWjfli4HADYmUMtYyo4A.jpg Křivky dávka-odpověď •Dávka vyjádřena např. mg/kg živé váhy, nebo mg/l •Řada důležitých údajů: •Prahová hodnota toxicity/dávka bez toxických účinků •Dávka vyvolávající plný efekt (např. 100% toxicitu) • práh? dávka •Je možné se otrávit vodou? •10 g kofeinu vyvolává křeče a zvracení (1 šálek kafe ~ 150 mg kofeinu) •NaCl ~ 250g smrtelná dávka •Způsob redukce křivky na jediné číslo: • •LD50 (střední letální dávka) dávka, která zabije 50 % populace v testu •LC50 (střední letální koncentrace) koncentrace, která zabije 50 % populace v testu • •ED50 (střední efektivní dávka) dávka, která vyvolá 50% účinek u pokusného modelu •EC50 (střední efektivní koncentrace) koncentrace, která vyvolá 50% účinek u pokusného modelu Křivky dávka-odpověď Křivky dávka-odpověď práh? Dávka 100% 50% LD50 = 50% jedinců exponovaných dané koncentraci zemře (expozice per os) mg/kg LC50 = 50% jedinců exponovaných dané koncentraci zemře (vodní organismy, expozice vzduchem) mg/l nebo mg/m3 http://dwb4.unl.edu/Chem/CHEM869Z/CHEM869ZLinks/www.curvefit.com/2023be90.gif ideální křivka Skutečná data (normalizovaná odpověď) Totéž po zlogaritmování koncentrace zkoumané látky 1. Způsob hodnocení -Lineární regrese •Proložení exponenciálního modelu lineární částí křivky dávka-odpověď v excelu •jednoduchý ale nepřesný •Vhodný pro odhad EC50 u „hezkých“ křivek • 2. Způsob hodnocení –probitová transformace •Probitová transformace linearizuje křivku a umožňuje snazší odhad EC50 •jednoduchý ale ne vždy přesný – vychází z normálního rozložení citlivosti •Vhodný pro odhad EC50 u „hezkých“ křivek • Log Dose Přímka (snadnější analýza) Log Dávka LD50 Transformováno na Probit 2. Způsob hodnocení – Nelineární regrese (logit) •– zahrne celou křivku dávka-odpověď, pokryje i okrajové části, je zpravidla lepší/spolehlivější, hlavně pokud počítáme hodnoty blízko okrajových částí křivky (EC20, EC80 – pravděpodobnost větší odchylky od linearity) •Důležité je, jak podrobně je proměřená křivka dávka odpověď ! •více bodů – lepší regrese •Je třeba specializovaný nástroj • GraphPad Prism – •Dostupná 30 denní zkušební verze http://www.graphpad.com/www/graphpad/assets/Image/img_mainproduct_11.jpg GraphPad Prism –příklad postupu •Create a new data file •New Project File •XY •Y: Enter 3 replicate values … (v případě triplikátů) •Create • No observed adverse effect level (NOAEL) •Experimentálně získaná hodnota– nejvyšší dávka (koncentrace) bez pozorovaných škodlivých účinků (bez statistické významnosti) •Lowest observed adverse effect level (LOAEL) •Nejnižší zkoumaná dávka (koncentrace) vyvolávající škodlivé účinky (statisticky významně) • http://toxlearn.nlm.nih.gov/htmlversion/images/6_6_dose_response_chart.jpg No observed adverse effect level (NOAEL) •Hodnocení např. pomocí GraphPad Prism (column analyses) •Převedení dat o toxicitě do formy sloupců (ordinální data) •Analýza pomocí one-way ANOVA •nutné prerekvizity dat: • - nezávislost měření (uvnitř skupin i mezi skupinami) •- normalita dat v každé skupině •- homogenita rozptylů uvnitř skupin (alespoň přibližná shoda rozptylů uvnitř skupin) •ANOVA informuje jen jestli je/není rozdíl mezi daty – neříká mezi kterými sloupci se rozdíl nachází •Pro porovnání sloupců je třeba použít post-hoc test např. Dunnetův test •