Bi3030c Fyziologie živočichů - cvičení
▪ docházka na cvičení (maximálně dvě absence – omluvená a
neomluvená, jinak si domluvit nahrazení cvičení)
▪ karanténa nebo příznaky nemoci > napište vyučujícímu!
▪ protokoly (odevzdávat průběžně do Odevzdávárny):
- jméno, příjmení, datum, téma cvičení
- stručný teoretický úvod související s podstatou úlohy (např. co
jsou bílkoviny, biuret apod.)
- stručný postup (kolik čeho, kam, jak dlouho… aby se dal podle
popisu experiment zopakovat)
- v krocích rozepsané vyhodnocení/výpočet
- závěr (zhodnocení výsledků v porovnání s teorií úlohy)
- protokoly vypracovávejte samostatně!
▪ zápočtový test (na konci semestru) + zkoušení během semestru
▪ demonstrace experimentů v ISu
▪ dodržujte bezpečnost práce!
▪ plášť a přezůvky dle vlastního uvážení, rukavice budou v případě
potřeby k dispozici v praktiku
Pipetování
▪ přesné odměřování objemů tekutin
▪ vždy dbejte na správný rozsah (přesnější je pipetovat v horní polovině
udávaného rozsahu pipety; nikdy nepipetujte mimo rozsah!)
▪ správné špičky
▪ výměna špiček
▪ přesnost a správná praxe pipetování
Výchozí pozice
1. zarážka
2. zarážka
Stanovení celkové koncentrace bílkovin
v tělních tekutinách
▪ proteiny
▪ biuretová reakce a její využití v praxi
▪ tělní tekutiny
▪ modelové organismy
▪ praktická část: stanovení koncentrace proteinů
Proteiny
▪ AMK spojené peptidovou vazbou
▪ vznik na ribozomech
▪ oligopeptidy (2–10 AMK), polypeptidy (11–50/100 AMK), vlastní
bílkoviny (více než 50/100 AMK)
Obecná funkce bílkovin:
▪ stavební
▪ transportní a skladovací
▪ zajišťující pohyb
▪ katalytické, řídící a regulační
▪ ochranné a obranné
Proteiny
▪ AMK spojené peptidovou vazbou
▪ vznik na ribozomech
▪ oligopeptidy (2–10 AMK), polypeptidy (11–50/100 AMK), vlastní
bílkoviny (více než 50/100 AMK)
Obecná funkce bílkovin:
▪ stavební (kolagen, elastin, keratin…)
▪ transportní a skladovací (hemoglobin, transferin…)
▪ zajišťující pohyb (aktin, myosin…)
▪ katalytické, řídící a regulační (enzymy, hormony, receptory…)
▪ ochranné a obranné (imunoglobulin, fibrin, fibrinogen…)
Proteiny
▪ AMK spojené peptidovou vazbou
▪ vznik na ribozomech
▪ oligopeptidy (2–10 AMK), polypeptidy (11–50/100 AMK), vlastní
bílkoviny (více než 50/100 AMK)
Funkce plazmatickcých bílkovin:
▪ imunitní (globuliny)
▪ hemostatická (fibrinogen)
▪ transportní (albuminy - nepolární tuky, cholesterol, steroidní hormony)
▪ onkotický tlak udržující funkce (albuminy)
▪ pH udržující (pufrovací) funkce
▪ řídící a katalytická (hormony, enzymy)
Tělní tekutiny
▪ funkce transportní, zásobní, opěrná atd.
Hydrolymfa (láčkovci, ostnokožci)
▪ roztok solí, málo bílkovin a volných buněk
Hemolymfa (hmyz, korýši, měkkýši)
▪ celková bílkovina okolo 6 %
▪ barviva, volné buňky, bílkoviny:
- zásobní proteiny (především larvální stádia)
- transportní proteiny (lipoforiny, transferin…)
- hormony (adipokinetický, prothoracikotropní, bursikon…)
- vitellogeniny (samičí proteiny, které tvoří hlavní součást
žloutkového váčku)
- imunitní proteiny (lysozym, koagulační proteiny…)
Tělní tekutiny
Krev (obratlovci) = plazma + krevní elementy
▪ transport cholesterolu, glukózy, tuků, iontů (Fe, Cl a další)
▪ bílkoviny krve (celková bílkovina 6-8 %):
albuminy (60 % plazmatických bílkovin) – vážou vodu, transport
Cu, Zn, mastných kyselin, hormonů
globuliny (40 % plazmatických bílkovin) – vážou tuk, hormony,
imunitní reakce (Ig)
fibrinogen, aj. (<1 %)
Tkáňový mok (extracelulární tekutina; bez plazmatických bílkovin)
Lymfa (z tkáňového moku; imunitní a transportní funkce)
Plodová voda, mozkomíšní mok, perilymfa a endolymfa v uchu, oční
komorová voda a další.
Celková bílkovina v plazmě obratlovců
Celková
bílkovina [g/l]
Celková
bílkovina [g/l]
žako 35-45 kajmanka 47
amazoňan 29-51 užovka 43
ara 26-43 zmije 55
andulka 14-36 krokodýl 65
jestřáb 24-31 varan 69
holub 15-35
kachna 35-45 skot 65-80
prase 65-85
jeseter 45 kůň 46-70
kapr 41,5 kočka 60-80
pstruh 34,6 pes 60-80
Pozn.: Hodnoty orientační (plazi, ryby vybrány z konkrétních studií, relativně malé n).
Stanovení proteinů – biuretová reakce
▪ důkaz bílkovin ve vzorku (reakce s peptidy tvořenými nejméně 3 AMK)
▪ biuretové činidlo 6mM CuSO4
5M NaOH
21mM C4H4KNaO6 (chelaton 3)
▪ peptidové vazby tvoří v alkalickém prostředí se solemi mědi
charakteristicky červenofialově barevný komplex - biuret
▪ biuret = kondenzační produkt dvou molekul močoviny
Stanovení proteinů – princip biuretové reakce
▪ v zásaditém prostředí proteinové řetězce vytvoří „matrix“ kolem Cu2+ >
fialová barva
▪ intenzita zbarvení je úměrná počtu peptidových vazeb
Stanovení proteinů – laboratorní praxe
▪ komerční kity, např. Bio-Rad Protein Assay:
- modifikace na mikrotitrační destičku
- 5 ul vzorku/standardu + 25 ul reagenčního roztoku A + 200 ul
reagenčního roztoku B
- po 15 min inkubace měřeno při 700 nm
- nutná kalibrační křivka
Modelové organismy
bourec morušový (Bombyx mori)
▪ Lepidoptera, Bombycidae
▪ produkce hedvábí
Modelové organismy
bourec morušový - zpracování hedvábí
▪ před vylíhnutím motýla je nutné kokony s kuklami usušit
▪ vaření kokonů
▪ vlákno (fibroiny)
▪ hedvábné proteiny (sericiny)
Modelové organismy
bourec morušový - zajímavosti
▪ monofágie (moruše)
▪ pohlavní dimorfismus (samička větší, terčíky)
▪ hybridi - monovoltinní druhy („jednosnůškové“) s bílým kokonem
- polyvoltinní druhy mající např. žlutý kokon (xantofyly)
▪ dospělec nelétá a nepřijímá potravu
▪ vyšlechtěn v Číně (3000 př. n. l.); dnes JV Asie, Japonsko, Brazílie
▪ vlákno až 1,5 km dlouhé
▪ 2 t listí > 120 kg kokonů > 20 kg hedvábí
Modelové organismy
myš domácí (Mus musculus)
▪ tradiční modelový organismus
▪ krev (krevní plazma / sérum + krevní buňky)
▪ majoritní proteiny 3-5 % albuminy
1-3 % globuliny
0,5 % fibrinogen
pes domácí (Canis lupus f. familiaris)
kočka domácí (Felis silvestris f. catus)
tur domácí (Bos taurus)
kapr obecný (Cyprinus carpio)
lín obecný (Tinca tinca)
karas obecný (Carassius carassius)
Praktická úloha
▪ 1 ml biuretového činidla + 20 µl blanku/standardu/vzorku > promíchat
blank (voda) k eliminaci absorbance samotného biuretového činidla
standard (komerční lidské sérum 70 g/l) k vypočítání celkové bílkoviny ostatních
vzorků
vzorky - hemolymfa bource (samička, sameček), zavíječe, sérum obratlovců
(myš, kapr, karas, lín, příp. jiné)
▪ 10-12 min inkubace > vizuální zhodnocení
▪ spektrofotometrické měření absorbance při 544 nm
▪ Lambert–Beerův zákon: koncentrace látky ve vzorku odpovídá jeho
absorbanci (přímá úměra)
c g/l = cs ×
A
As
Celková koncentrace
bílkovin v měřeném
vzorku
Koncentrace bílkovin
standardu (70 g/l)
Absorbance vzorku
Absorbance standardu
Praktická úloha
1 2 3 4 5 6 7
Biuretové činidlo 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Standard 20 µl
Blank (H2O) 20 µl
Hemolymfa samce bource 20 µl
Hemolymfa samice bource 20 µl
Fetální bovinní sérum (FBS) 20 µl
Rybí sérum 20 µl
Psí sérum 20 µl
…stejně i další vzorky