Blokové cvičení z Metod aplikované biochemie a buněčné biologie 2019 Jméno: Modelový systém: HEK 293 – Human Embryonal Kidney – epiteliální charakter https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx?geo_country=cz Agonista antagonista https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301468117300774 A) V nepřítomnosti Wnt ligandů, nebo v případě zablokování dráhy (DKK1, SFRP) je cytosolický b-catenin konstitutivně fosforylován v destrukčním komplexu (APC, CK1, AXIN, GSK3), následně ubiquitován a degradován v proteasomu. ZNRF3 a RNF43 (E3 ubiquitin ligázy) ubiquitinují a tak destabilizují receptory Frizzled a LRP a tak inhibují Wnt signalizaci. B) Vazba Wnt ligandů (Wnt3a) na jejich receptor inhibuje destrukční komplex, b-catenin se akumuluje, translokuje do jádra a umožňuje přepis genů, které mají v promotoru vazné místo pro TCF/LEF transkripční faktor, na který se b-catenin váže. R-spondin (RSPO) posiluje Wnt signalizaci, protože vytváří ternární komplex LGR proteinů s ZNRF3/RNF43, který indukuje autoubiquitinaci ZNRF3/RNF43, což vede k jeho degradaci v proteasomu. Wnt3a b-catenin RNF43 RSPO Ve zkratce: > > Vzorky: 1. CTR = catenin kontrolní hladina (450 ul DMEM) 2. WNT3a = catenin (300 ul DMEM + 150 ul CM Wnt3a) 3. RSPO = catenin (300 ul DMEM + 150 ul CM RSPO) 4. WNT+ RSPO+ = catenin (150 ul DMEM + 150 ul CM Wnt3a + 150 ul CM RSPO) PROTOKOLY Kultivace buněk Pasážování a vysévání buněk HEK 293 buňky (HEK) se kultivují na polystyrenových miskách firmy TPP v inkubátoru Heraeus (teplota 37 ˚C, 5 % CO[2] a 95 % vlhkost) v kultivačním mediu DMEM (Dulbecovo modifikované Eaglovo médium, High glucose, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) s přídavkem 10 % FBS (fetální hovězí sérum, Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1,2 mM L-glutaminu (Gibco, Thermo Fisher Scientific), a 100 U/ml Penicilinu/Streptomycinu (HyClone, Thermo Fisher Scientific). V dalším textu bude tato směs označována jako DMEM médium, pokud nebude specifikováno jinak. Pasážování zásobních HEK buněk je nutné provést každé cca tři dny nebo po dosažení 80 % konfluence. Buňkám se odsaje médium, opatrně se opláchnou 5 ml PBS (fosfátový pufr; phoshate buffered saline, pH 7,4) a pro enzymatické uvolnění buněk od povrchu misky se používá 0,5 ml Trypsin-EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová; Biotech, LM-T1706/100, Onsala, Švédsko). Po 2 minutách inkubace HEK s Trypsin-EDTA v inkubátoru by mělo dojít k uvolnění buněk, pro vizuální kontrolu buněk použijeme inverzní mikroskop CKX 41 (Olympus, Tokio, Japonsko). Následně zneutralizujeme Trypsin přídavkem 2 ml média DMEM. Suspenzi buněk (2 ml) přeneseme do 15 ml zkumavky. Cca 20 ul suspenze kápneme do Burkerovy komůrky. Zbytek buněk stočíme (200 g/RT/5 min), resuspendujeme v 1 ml média DMEM. Spočítáme buňky ve 20 středních čtvercích, výsledná suma je označena jako p Množství buněk v 2 ml suspenze = 2. p. č. h .10^3= p. 500 .10^3= p.25 .10^3 y 20 č… reciproká hodnota plochy políčka (25) h… reciproká hodnota výšky komůrky (10) y… počet políček y (20) Vysejeme 50 000 buněk na jednu 24W jamku (0,5 ml) (celkem 4+1 jamky = 250 000 buněk = 0,25 x10^6) Výpočet: M x 10^6 …. 1 ml 0,25 x 10^6 …. X ml Ze suspenze odebereme X ml a přidáme DMEM tak, aby celkový objem byl 5 x 0,5 ml = 2,5 ml (tj. 2,5 – X ml) Důkladně promícháme a do každé 24W jamky vysejeme 0,5 ml výsledné suspenze, zamícháme S-J+V-Z. Vložíme do inkubátoru Transfekce buněk Příprava transfekčních směsí – na 1 jamku: SS plazmidu 500ng/ul 1. 100 ul DMEM pure + 150 ng každého plazmidu (celkem 0,45 ug DNA) výpočet: 500 ng…. 1 ul 150 ng…. x ul 2. 100 ul DMEM pure + 1,8 ul PEI (poměr DNA : PEI = 1:4, tj. 0,45x4 = 1,8) pRLtkLuc Super8X TOP Flash pmax GFP Výpočet: DMEM pure 345 368 pmax PEI 1 jamka 100 ul 1,8 ul 5 jamek Připravené transfekční směsi důkladně zvortexujeme, krátce stočíme a necháme 15 minut inkubovat při RT. Obě zkumavky smícháme, důkladně promícháme a opět 15 minut inkubujeme při RT. Do každé jamky přidáme 205 ul výsledné transfekční směsi. Po 3 hodinách odsajeme vše z jamek, přidáme DMEM a 150 ul kondiciovaného média (CM) s WNT3a (W+) nebo Respondinem (R+) (dle rozpisu vzorků). Vše inkubujeme přes noc v inkubátoru. Stanovení účinnosti transfekce 1. Mikroskopicky - Fluorescenci vzorků způsobenou expresí plazmidu pMAX s GFP nafotíme na konfokálním fluorescenčním mikroskopu Leica kombinací zeleného filtru a průchozího světla, abychom byli schopni určit jak množství svítících buněk, tak počet všech buněk v zorném poli. Výsledek je poměr pozitivních buněk ku všem buňkám. Výsledek: Účinnost transfekce PEI je přibližně %. Metoda TopFlash = Dual Luciferase Assay (kit Promega ) Odsajeme médium Přidáme opatrně 1 ml PBS, odsajeme, na sucho inkubujeme v -80 °C Rozmrazíme pufr LAR II a Stop & glow buffer Naředíme si 5x lyzační pufr – 1 jamka 50 ul, 5 jamek 250 ul, tj. 200 ul MQ H[2]0 + 50 ul 5x lysis buffer Přidáme 50 ul 1x lyzačního pufru do každé jamky a inkubujeme 15 min/RT na třepačce Naředíme si 100x Stop & glow reagent v Stop & glow buffer (25 ul na jamku, tj. 125 ul) Výpočet: ul Stop & glow buffer + ul Stop & glow reagent Nachystáme si luminometr a stripy na měření Do stripu nakapeme 20 ul lyzátu z každého vzorku (důkladně zhomogenizovaného) U luminometru velmi rychle přikápneme 25 ul LARII substrátu pro firefly (FF) luciferázu Změříme chemiluminiscenci Přidáme Stop & glow substrát pro renilla (R) luciferázu (inhibice aktivity FF luciferázy, substrát pro R luciferázu) Změříme chemiluminiscenci Výslednou hodnotu spočítáme jako podíl FF luciferázy a R luciferázy Výsledek: Stanovení účinnosti transfekce fluorimetricky Lyzát z TopFlash metody napipetujeme do stripu pro fluorescenční měření a změříme při excitaci 480 nm a emisi 510 nm. Spočítáme poměr fluorescence vzorku ku nenatransfekované kontrole. Výsledek: -K (buňky bez plazmidu) K Wnt3a RSPO Wnt3a+RSPO qRT-PCR Izolace mRNA Ve dni 0 bylo k 70 % konfluentním buňkám přidáno CM dle rozpisu. Vzorky opatrně opláchneme PBS a poté přidáme 350 μl lyzačního pufru RLT s 1 % merkaptoethanolem (Sigma Aldrich) Výpočet: 5 vzorků = ul RLT + ul merkaptoetanolu K izolaci mRNA použijeme návod z komerčního kitu RNAeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Německo) Vzorky přeneseme do 1,5 ml zkumavky, přidáme 350 ul 70 % etanolu, pipetou důkladně zamícháme (precipitace) Přeneseme do kolonky vložené do 2 ml sběrné zkumavky Centrifugace 10000 RPM/30 s, vylejeme proteklou tekutinu (RNA navázána na kolonku) Přidáme 700 ul pufru RW1, centrifugace 10 000 RPM/30 s, vylejeme proteklou tekutinu (promývání) Přidáme 500 ul pufru RPE, centrifugace 10 000 RPM/30 s, vylejeme proteklou tekutinu (promývání) Přidáme 500 ul pufru RPE, centrifugace 10 000 RPM/2 min, vylejeme proteklou tekutinu (promývání) Vyměníme 2 ml sběrací zkumavku a centrifugujeme 13 000 RPM/1 min Vyměníme 2 ml zkumavku za 1,5 ml zkumavku, přidáme 30 ul RNase-free H[2]0, centrifugace 10 000 RPM/1 min (eluce) Eluát ještě jednou naneseme do kolonky a znovu zcentrifugujeme 10 000 RPM/1 min Naředíme si 1 ul vzorku + 9 ul RNase free H[2]O a změříme koncentraci vyizolované mRNA na spektrometru NanoDrop® ND-1000 Spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Izolovanou celkovou RNA uchováváme v –80 ˚C. Přepis mRNA do cDNA = reverzní transkripce Reverzní transkripce slouží k vytvoření templátu DNA (cDNA = complementary DNA), který bude vstupovat do polymerázové řetězové reakce (PCR). Celý proces je založen na použití reverzní transkriptázy, což je RNA dependentní DNA-polymeráza. Po celou dobu práce je nutné vzorky uchovávat na ledu kvůli jejich nestabilitě. PRÁCE NA LEDU! Z celkové RNA odebereme 1 ug (výpočet), který doplníme RNase free H[2]O do objemu 11,5 ul. Přidáme 1 μl 20 mM Oligo(dT), inkubace vzorků 5 minut při 65 ˚C (PCR cykler). Přidáme 4 μl 5x RT reakčního pufru, 2 μl 10 uM směsi nukleotidů dNTP, 0,5 μl (20 U) RNázového inhibitoru RiboLock a 1 μl (200 U) RevertAid reverzní transkriptázy (vše Thermo Fisher Scientific). Zamícháme a krátce centrifugujeme, inkubace hodinu při 42 ˚C a dalších 10 minut při 70 ˚C pro denaturaci enzymu, čímž ukončíme reakci. Vzorky cDNA jsou skladovány při -20 ˚C. Výpočet: Vzorek koncentrace RNA 1 ug RNA (ul) H[2]O (do 11,5 ul) Reakční mix pro RT: 1 vzorek 5 vzorků 5x RT reakční pufr 4 ul dNTP 2 ul RiboLock 0,5 ul RevertAid RT 1 ul Real time PCR 1. Do každé jamky (20 ul) patří: 1,5ul cDNA templátu 18,5 ul Master mixu: 3 ul 2xcc Roche - LighCycler 480 SYBR green I master kit (směs nukleotidů, FastStart Taq DNA polymeráza, SYBR green, MgCl[2]) 0,375 ul každého z primerů (SS 20 uM) vypočítej výslednou koncentraci: 1,7 ul MgCl[2] (SS 25 mM) vypočítej výslednou koncentraci: Doředit do 18,5 ul sterilní RNase-free MQ H[2]O Detekované geny: HPRT, cMyc (míchá skupina A,C), Axin2, cyklin D1 (míchá skupina B, D) Sybr green 1. primer 2. primer MgCl[2] H[2]O 1 vzorek 3 0,375 0,375 1,7 13,05 ul 16+4 vzorky 60 7,5 7,5 34 261 ul Do jamek na dno napipetovat v duplikátu (vedle sebe) master mix pro daný gen Všechny tři geny vedle sebe (v pořadí uvedeném výše) Přidat 1,5 ul cDNA všech vzorků (podle rozpisu) na horní část jamky HPRT cMyc Axin2 CD1 Zcentrifugovat 5 min/4 °C, vložit do LC 480 (Roche) A K 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Skupina A,C 12 B W C R D WR E K Skupina B,D F W G R H WR Dopiš do obrázku teploty a dobu pro jednotlivé fáze cyklu 40 cyklů Vyhodnocení podle maxima 2. derivace křivky Výsledek: Western blotting Příprava SDS lyzátů Ve dni 0 bylo k 70 % konfluentním buňkám přidáno CM dle rozpisu. Ze vzorků odsajeme médium a opatrně přidáme 1 ml PBS, které také odsajeme Přidáme 100 ul lyzačního pufru SDS (sodium dodecyl sulfate, 2 % SDS, 10 % glycerol a 100 mM TRIS pH 6,8.). Inkubujeme 10 minut na ledu a následně přeneseme do zkumavek (vzorky je možné uchovávat v -20 °C). PRÁCE NA LEDU! Rozbití buněčných struktur a DNA provedeme sonikací a vařením na 95 °C/5 min v bločku. Kvantifikace proteinů kitem DC protein Assay (Bio Rad, Hercules, USA) Do 96W panelu nakapeme 5 ul každého lyzátu v duplikátu (v řádku), přidáme také proteinové standardy (0-4 mg/ml). Nachystáme si směs roztoků A (zásaditý roztok tartátu mědi) a S (SDS) v poměru 50:1, přičemž do jedné jamky budeme kapat 25 ul této směsi. Výpočet: 22+3 jamky = 25 jamek x 25 ul = 625 ul Roztok A ul + Roztok S ul K 5 ul buněčného lyzátu přikápneme 20 ul směsi A+S a 200 ul roztoku B (Folinovo reagens – poměděný protein redukuje Folinovo reagens, které tak zmodrá) Inkubujeme 10 min/RT (shaker), měříme absorbanci při 700 nm (ELISA reader) Výpočet koncentrace proteinů v jednotlivých vzorcích z kalibrační přímky absorbancí standardů. Naředíme vzorky na nejvyšší společnou koncentraci SDS lyzačním pufrem. Přidáme roztok 10 % merkaptoetanolu (Sigma, 63689) s 1 % bromfenolovou modří (Sigma, 114391) v SDS lyzačním pufru, a to vždy 10 % celkového objemu jednotlivého vzorku. SDS-polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE) 2x polyakrylamidový gel 8 %, tloušťka 1 mm, 10 jamek Před nanesením vzorků na gel je důkladně zvortexujeme. Do každé jamky v gelu napipetujeme 20 μl z každého vzorku (1-8) a do krajních jamek napipetujeme 1,5 μl barevně značeného proteinového standardu (PagerRuler Plus Prestained Protein Ladder, ThermoScientific). Elektroforéza 130 V 1 hodinu (proteiny, jež díky SDS získaly záporný náboj, migrují ke kladné elektrodě). Wet blotting Přeneseme gely s proteiny rozseparovanými podle MW na metanolem aktivovanou PVDF (Polyvinylidene difluoride) membránu (Immobilon-P membrane, Merck, Kenilworth, USA), vyrobíme tzv. sandwich, důležité je myslet na to, že proteiny migrují ke + elektrodě a musí přitom přejít z gelu na membránu. Složení použitých roztoků: Transferujeme proteiny na PVDF 100 V/70 minut, membránu vyjmeme, opláchneme promývacím pufrem. Blokujeme nespecifické vazby protilátek pomocí inkubace 20 minut v blokačním pufru (5 % roztok netučného sušeného mléka rozpuštěného v promývacím pufru). Imunodetekce Nařežeme membránu na proužky, kde předpokládáme výskyt hledaných proteinů podle barevných standardů. Proužky vložíme do 50 ml falcon zkumavky, ve které jsou 3 ml roztoku blokačního pufru s příslušnými specifickými I. Ab protilátkami v příslušné koncentraci (viz obrázek). kDa 250 130 100 72 55 35 pS1490-LRP6 150-250 kDa (cs-2568, 1:1 000) R Aktivní b catenin (ABC), 92 kDa (Millipore5665, 1:1000) M Aktin b 42 kDa (sc-1615, 1:1 000) G Inkubujeme přes noc 4 °C, na rolleru Membrány druhý den přemístíme do misky a třikrát opláchneme promývacím pufrem po dobu 10 minut (shaker). Připravíme nové falconky s 3 ml blokačního pufru se sekundárními protilátkami (II. Ab), konjugovanými s křenovou peroxidázou, ředěnými 1:5 000. Do II. Ab vložíme opláchnuté membrány (dle druhové specifity I.Ab) a inkubujeme na rolleru 60 minut/RT. Membrány přemístíme do misky a třikrát opláchneme promývacím pufrem po dobu 10 minut (shaker). Nachystáme si substrát pro peroxidázu s obsahem peroxidu vodíku a luminolu (Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate, Merck Millipore) – smícháme obě složky v poměru 1 ml : 1 ml. Membrány znovu seřadíme a zalijeme substrátem, který špičkou rovnoměrně rozmístíme a překryjeme fólií. Detekci signálu provedeme pomocí programu FusionSL a zařízení s CCD kamerou (Fusion SL, Vilber), které detekuje chemiluminiscenci vzniklou oxidací luminolu po rozštěpení peroxidu vodíku peroxidázou. Závěr: Napište, jak odpovídají naše výsledky předpokladům