qRT-PCR Izolace celkové RNA uRneasy total RNA isolation kit (Quiagen) uhttps://www.youtube.com/watch?v=8zVGVFCs2mA uPodrobný návod: uhttps://www.qiagen.com/cz/resources/resourcedetail?id=14e7cf6e-521a-4cf7-8cbc-bf9f6fa33e24&lang=en u1x10*6 – 1x10*7 buněk opláchnutých PBS RLT pufr + 1% 2ME RW1 pufr, 2x RPE pufr RNAse free H2O Kvantifikace RNA a výpočet pro zpětnou transkripci 1.Kontrola kvality RNA 1.Absorbance 260 by měla být 0,2-1,2 jinak naředit 2.Poměr A260/280 by měl být kolem 2,1 3.Poměr A260/230 by měl být kolem 2, pod 1,8 nevhodné pro RT 2.Odečet koncentrace RNA 3.V kolika ul je 1000 ng? 1000/91,6 = 10,9 ul odebereme na RT, doředíme do 11,5 ul RNase free H2O 4. Přidáme 1 μl 20 mM Oligo(dT) 5. Inkubace vzorků 5 minut při 65 ˚C (PCR cykler). 6. Připravíme reakční mix: 1 vzorek x vzorků 5x RT reakční pufr 4 ul dNTP 2 ul RiboLock 0,5 ul RevertAid RT 1 ul 7. Připipetovat po 7,5 ul, celkový objem 20 ul 8. Inkubace při 42 °C po 1 h (PCR cykler) 9. Ukončení reakce denaturací RT při 70 °C/10 min http://www.u.arizona.edu/~gwatts/azcc/InterpretingSpec.pdf Primery - příklad https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1605692810&job_key=gYte8UoM R6RgmkKfT_9mrTXkd58Y92yCGQ Otestování kvality primerů a zjištění optimální annealingové teploty http://oligo.net/downloads.html Nalezení vhodného templátu mRNA https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ Nastavení parametrů pro design primerů https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?ORGANISM=9606&INPUT_SEQUENCE=NM_004996.4& LINK_LOC=nuccore Design primerů Délka a sekvence primerů (SW Oligo) • Primery jsou obvykle 20-25 nt dlouhé. • Primery v daném páru musí mít srovnatelný počet GC:AT párů. Upřednostňujeme primery s 50 – 60% obsahem GC nebo AT párů. • Sekvence mezi oběma primery nesmí být výrazně komplementární, vznikaly by tzv. dimery – Oligo SW • Rovněž nesmí být komplementarita v rámci sekvence primeru. Došlo by ke vzniku vlásenky • LG dimer vlasenka Základy navrhování primerů • v běžném zápisu sekvence DNA se zapisuje horní vlákno z dvouřetězcové molekuly DNA, a to ve směru 5’->3’. • Sekvence předního („forward“) primeru je totožná se sekvencí běžně zapisovaného, tj. horního vlákna. Přední primer umožňuje syntézu horního vlákna podle templátového spodního vlákna. • Zadní („reverse“) primer se navrhuje jako komplementární sekvence k hornímu vláknu, která je navíc v reverzní orientaci, tzn., že je zapisovaná ve směru 3’->5’. Takže při navrhování sekvence reverse primeru podle horního řetězce, musíme číst sekvenci primeru odzadu. Reverse primer umožňuje syntézu dolního vlákna podle templátového horního vlákna. • LG nasedani primeru copy Teplota annealingu primerů •Čím větší délka a vyšší obsah GC párů, tím je teplota nasedání vyšší •Teplota nasedání primerů musí být dostatečně vysoká, aby nedošlo k nespecifickému nasedání primerů k templátové DNA, pokud by ale byla příliš vysoká, primery by nenasedaly vůbec. •Je třeba, aby teplota nasedání byla optimální pro oba primery a obsah GC párů v obou primerech byl srovnatelný, tzn., aby byla srovnatelná teplota nasedání obou primerů. • Pro výpočet teploty primerů můžete použít některý ze SW – oligo •Se zvyšující se koncentrací Mg2+ se zvyšuje annealingová teplota Co zohlednit při navrhování primerů: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?ORGANISM=9606&INPUT_SEQUENCE=NM_004996.4& LINK_LOC=nuccore PCR product size: SybrGreen 100-500, sonda UPL (Roche) cca 70-150 Exon junction span – primers must span exon-exon junction Allow primer to amplify mRNA splice variants (requires refseq mRNA sequence as PCR template input Ředění primerů 1. Když k lyofylizátu přidáme 267 ul dostaneme koncentraci 100 pmol/ul = 100 uM (uM/l) 2. Ředíme na výslednou koncentraci 0,1-1 µM podle toho, aby se nám to vešlo do lahvičky (2 ml) 20 uM, 40 uM nebo Real time PCR Templátová DNA: 1,5 ul cDNA do každé jamky Primery: pro 25 µl reakci použijeme 0,25-2,5 µl z obou primerů. Množství primerů musí být optimální. Příliš vysoká koncentrace vede k nespecifickému nasedání primerů na templátovou DNA nebo párování primerů navzájem. Příliš nízká koncentrace primerů může vést k nedostatečnému množství produktu. dNTP směs: je směs dATP, dCTP, dGTP a dTTP. Obvyklá koncentrace každého dNTP v reakci je 200 µM (0,2 mM). MgCl2: obvyklá koncentrace je 1,5 mM. MgCl2 je nutný pro procesivitu a přesnost Taq polymerázy. Koncentrace MgCl2 se odvíjí od koncentrace dNTP a platí, že pro specificitu reakce musí koncentrace MgCl2 převyšovat koncentraci dNTP. Pro zvýšení specificity reakce zvyšujeme koncentraci MgCl2, a to až k 5 mM, přičemž koncentraci dNTP držíme stále na stejné úrovni. Někteří výrobci Taq polymerázy dodávají MgCl2 zahrnuté do reakčního pufru. SybrGreen: Interkalační barvivo je součástí reakčního pufru, ale v rámci šetření ředíme. Kontroly: Používáme negativní a pozitivní kontrolu, pokud je to možné. V negativní kontrole použijeme místo testovaného vzorku vodu, tzn., negativní kontrola neobsahuje testovanou DNA. Pozitivní kontrola naopak obsahuje takovou DNA, která nám zajistí vznik požadovaného produktu. Real time PCR mix Sybr green 1. primer 2. primer MgCl2 H2O 1 vzorek 3 0,375 0,375 1,7 13,05 ul x vzorků Celkem 20 ul v jamce: 1,5ul cDNA templátu 18,5 ul Master mixu: 3 ul 2xcc Roche - LighCycler 480 SYBR green I master kit (směs nukleotidů, FastStart Taq DNA polymeráza, SYBR green, MgCl2) 0,375 ul každého z primerů (SS 20 uM) 1,7 ul MgCl2 (SS 25 mM) Doředit do 18,5 ul sterilní RNase-free MQ H2O Pipetování reakcí: https://www.youtube.com/watch?v=0rCxdtlXNj8 Hodnocení kvantitativní real time PCR uUrčení Ct (Cp) – manuálně nebo pomocí maxima 2. derivace - bod, kde dochází k strmému stoupání amplifikační křivky vzorku uČím vyšší Ct, tím méně molekul mRNA bylo ve vzorku u Model PCR plot https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techqpcr/ Výsledek obrázku pro q real time PCR Křivka tání (melting curve) uNa konci reakce proběhne postupné zahřívání celé reakce, po dosažení bodu tání Tm dojde k degradaci DNA (pokles fluorescence) uSpecifitu reakce ilustruje křivka tání (melting curve) – u musí mít jen jeden vrchol = jeden produkt u http://labguide.cz/metody/real-time-pcr/ Více info: https://theses.cz/id/go0fw3/Bakalarska_praceEliska_Ruzickova.pdf ######## Samples MeanCp hprt myo D DCp 2^-DCp x10 na K 1 k 1d A1, B1 19,75474 19,58113 0,17361829 0,8866163 8,866163 1 1 a26 1d A2, B2 20,6692 19,33026 1,33894189 0,3953105 3,953105 0,445864 1 a30 1d A3, B3 19,99559 19,50746 0,4881269 0,7129501 7,129501 0,804125 Hodnocení kvantitativní real time PCR Velmi důkladné video o celé RT PCR https://www.youtube.com/watch?v=9UWKIFGh0h0