Fluorescence chlorofylu úplné základy - přehled Přednáška č. 1 Miloš Barták OEBR ÚEB PřF MU, Brno Podzimní semestr 2020 [USEMAP] Chlorofyl - absorpce [USEMAP] Excitace molekuly chlorofylu po absorbování zářivé energie Jablonského diagram Fluorescence : zářivá deexcitace prvního singletního (excitovaného) stavu molekuly chlorofylu F S1, S2 singletní excitované stavy T – tripletní stavy [USEMAP] Spolupůsobící deexcitační cesty Ph : fotosyntéza (Lin. Elektron. Transport) IC: Termální disipace (uvolnění tepla) Fluorescence chlorofylu Plus mechanismy nefotochemického zhášení) Plant is ´happy´ Plant under heavy stress [USEMAP] Emise fluorescenčního záření: 690 nm (fotosystém II, PSII) 740 nm (fotosystém I, PSI) [USEMAP] Základní rozdělení metod fluorescence chlorofylu •Měření aktuální hodnoty (signál-u) •Měření indukčních křivek (d.a. – l.a) •Rychlá indukční klinetika (křivka) OJIP •Pomalá (Kautského) kinetika •Měření parametrů fluorescence chlorofylu odvozených z křivek •OJIP parametry (přibližně 30 různých) •Pomalá (Kautského) kinetika doplněná o saturační pulsy (8 hlavních) • • [USEMAP] Příklad 1 Teplotní křivka fotosyntézy Měření (celkového) fluorescenčního signálu V závislosti na teplotě (lineární oteplování vzorku konstantní rychlostí) [USEMAP] Příklad 1 Teplotní křivka fotosyntézy Detekce bodů M1 a M2 Různé fáze teplotou-indukované destrukce PSII a thylakoidní membrány chloroplastu [USEMAP] http://www.frontiersin.org/files/Articles/108567/fpls-05-00746-HTML/image_m/fpls-05-00746-g009.jpg [USEMAP] http://www.hansatech-instruments.com/wp-content/uploads/2013/07/kautsky.png http://www.hansatech-instruments.com/wp-content/uploads/2013/07/parameters-measured.png [USEMAP] [USEMAP] http://www.mdpi.com/sensors/sensors-12-11853/article_deploy/html/images/sensors-12-11853f1-1024.png Výsledek obrázku pro fast Kautsky kinetics [USEMAP] https://www.scienceopen.com/document_file/7be0d28e-675e-4d71-be0c-ee0b2b63f876/PubMedCentral/image/ pone.0049839.g001 [USEMAP] Vliv základních abiotických faktorů na fluorescenci chlorofylu Detekce stresu pomocí OJIP Přehledná souborná práce Kalaji et al. (2016) [USEMAP] [USEMAP] Vliv iontů těžkých kovů na OJIP – Ciscato et al. 1999 [USEMAP] Khalida et al. 2012 Vliv iontů chromu na OJIP (průběh) [USEMAP] Pomalá (Kautského) kinetika fluorescence chlorofylu Doplněná o metodu saturačních pulsů Saturační pulsy umožňují rozlišit, jaký díl absorbované zářivé energie je spotřebován v procesu fotosyntézy: qP – fotochemické zhášení fluorescence chlorofylu … rovněž také podíl energie spotřebovaný jinak než ve fotosyntéze: qN – nefotochemické zhášení fluorescence chlorofylu (ochranné mechanismy aktivované při působení stresu) KK [USEMAP] KK Aktinické (kontinuální záření) Předzatemnění 5 minut Saturační puls Saturační puls [USEMAP] Parametry fluorescence chlorofylu odvozené z pomalé KK doplněné o metodu saturačních pulsů: Kapacita fotochemických procesů fotosyntézy v PSII nebo také Maximální kvantový výtěžek PSII Nebo také Potenciální kvantový výtěžek fotochemických procesů v PSII Nebo také Základní fluorescenční poměr Fv/Fm = (Fm –Fo)/ Fm Udává potenciální fotosyntézu ve fotosystému II Měří se na předzatemnělém materiálu aplikací saturačního pulsu KK Fv/Fm [USEMAP] Parametry fluorescence chlorofylu odvozené z pomalé KK doplněné o metodu saturačních pulsů: Efektivní kvantový výtěžek fotochemických procesů fotosyntézy ve fotosystému II nebo také Yield of PSII FPSII = (Fm´ – Fs)/ Fm´ Udává aktuální rychlost fotochemických procesů fotosyntézy Měří se na vzorku adaptovaném na světlo (5 min). Hovoříme o Rovnovážném stavu (steady state chlorophyll fluorescence) KK FPSII [USEMAP] Parametry fluorescence chlorofylu odvozené z pomalé KK doplněné o metodu saturačních pulsů: Nefotochemické zhášení (qN) je tvořeno třemi základními součástmi podle charakteru fyziologického procesu, který se ve fotosyntetickém aparátu uplatňuje: qE energetické zhášení fluorescence (závislé na pH gradientu) qT zhášení způsobené odpojením LHC II (fosforylací) a jejich přesunem od PS II k PS I qI fotoinhibiční zhášení fluorescence (působené radiačním stresem) Pro stanovení těchto součástí je nezbytné vystavit rostlinný materiál saturačním pulsům, a to s využitím speciálního postupu qN = qE +qT +qI [USEMAP] http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya/contents/v79/full/79040379Fig10.gif Jak měřit qE, qI, qT [USEMAP] Khalida et al. 2012 Vliv iontů chromu na Průběh KK u Scenedesmus obliquus Nalezněte a zaznamenejte si (sami) vliv Cr na: (1)Fm a Fm´ (2)Fs (3)Fp (4) (4)Porovnejte Obr. A a F A F Fm Fm´ Fs Fp Fm Fm´ Fs Fp KK [USEMAP] Toto je úplný základ Následují přednášky 2-12 Bi5880 Pokročilé metody indukované fluorescence chlorofylu [USEMAP]