Metody detekce buněčné smrti (apoptózy) u nádorových buněk
MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE EUKARYOT-CVIČENÍ (14. – 18. 12. 2020)


Apoptóza je fyziologický proces
•embryogeneze / organogeneze
•odstranění poškozených a nefunkčních buněk
Změny v regulaci apoptózy jsou patologické
•snížená vs. zvýšená míra apoptózy v různých tkáních
ANd9GcTWJwLaV1J8J12i_c0RJ6sU1Q4D8D08PdHHLPTsuOmess4zWSi9yBxEXZ6Z
https://cdn.webnoviny.sk/sites/13/2015/02/rakovina-choroba-pacient-nemocnica-hospitalizacia-zdravie
-liecit-640x426.jpg

http://www.celldeath.de/encyclo/aporev/revfigs/rev_2.jpg
Apoptóza vs. nekróza
+ další typy b. smrti: anoikis, aponekróza, nekroptóza, mitotická katastrofa, autofagie...

•kaspázy = proteázy
•iniciační kaspázy: 8, 9
•efektorové kaspázy: 3, 6, 7
Apoptóza je regulovaný proces – velký význam buněčné signalizace

Cisplatin-stereo.svg Etoposide.svg



http://www.solentim.com/products/cell-gallery/cell-gallery-mdamb231/
MDA-MB-231
kultivace v médiu RPMI 1640 (Sigma)
+10% fetální bovinní sérum (FBS)
+ 2 mM L-glutamin
+ Pen/strep = penicilin (100 U/ml) a streptomycin (100 μg/ml)

1.SDS PAGE elektroforéza a westernový přenos - detekce štěpeného proteinu PARP
http://www.oswego.edu/Images/maspec/proteanmini.jpg
http://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/WesternBlotSetup.gif
http://advansta.com/images/Figures/WB%20Quantum/WBQ_home-Fig1.jpg

2. Detekce mrtvých buněk prostřednictvím SYTOX Green Nucleic Acid Stain a průtokového cytometru
https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/figures/S34860_1.JPG-650.jpg
+ jednoduchá a rychlá metoda
- nerozlišíme jednotlivé typy buněčné smrti

3. Barvení nukleových kyselin propidium jodidem (interkalační činidlo) – vyhodnocení počtu
apoptotických jader pomocí fluorescenčního mikroskopu
http://jcs.biologists.org/content/joces/114/20/3643/F4.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1
apoptóza vs. mitóza

4. Stanovení subG1 fáze buněčného cyklu na průtokovém cytometru
5. detekce štěpené DNA na agarózovom gelu

subG1 fáze zcela vlevo – nízký obsah DNA

delší kultivace buněk s cytotoxickou
látkou = nárůst degradace DNA