Mikroskopické houby - cvičení Obsah: 1. Izolace mikroskopických hub - metoda přímého výsevu 2. Izolace mikroskopických hub - ředící metoda 3. Izolace mikroskopických hub sterem z prostředí 4. Izolace vodních hyfomycet 5. Izolace mikroskopických hub z osiva (seed born fungi) 6. Příprava čisté kultury 7. Příprava mikrokultury (sklíčkové kultury) 8. Identifikace vláknitých hub rodu Aspergillus 9. Identifikace vláknitých hub rodu Penicillium 10. Identifikace vláknitých hub rodu Fusarium 11. Identifikace vláknitých hub řádu Mucorales 12. Nativní preparát - mikroskopování 13. Seznam médií používaných v mykologii -1/42- 1. Izolace mikroskopických hub - metoda přímého výsevu Materiál: koření, bylinné čaje Pomůcky: pinzeta, kultivační médium (MA2% - Malt Extrakt Agar s chloramfenikolem, DRBC), termostat na 25 °C Pracovní postup: 1. Vzorek rovnoměrně rozprostřeme po povrchu kultivačního média. 2. Kultivujeme ve tmě, při teplotě 25 °C po dobu 7 dnů. 3. Mikroskopování, identifikace Úkoly: Proveďte rodovou či druhovou identifikaci izolátů. 2. Izolace a kvantifikace půdní mykoflóry ředící metodou Princip: Půdní vzorek určitého objemu roztřepeme ve standardním objemu sterilní vody a dále ředíme. V několika ředěních vyséváme na misky s agarovou půdou. Metoda vychází ze základního empiricky ověřeného předpokladu, že z 1 životaschopné buňky vyrůstá 1 kolonie. Životaschopné buňky vytvářejí na agarovém živném mediu viditelné makroskopické kolonie. V případě izolace a kvantifikace půdní mykoflóry se používá např. půdní agar s glukosou a bengálskou červení, která má antibakteriální účinek a snižuje rychlost růstu hub. Materiál: půda Pomůcky: zkumavky se sterilní vodou, špičky, automatické pipety, kultivační médium (SEA - Soil Extract Agar - Půdní agar s glukosou a bengálskou červení), L-klička, třepačka, termostat. Pracovní postup: 1. Připravíme výchozí suspenzi vzorku v 9 násobku sterilní dest. vody. Homogenizujeme ručně nebo na třepačce 10-20 min. 2. Pomocí pipety z výchozí suspenze přeneseme 1 ml do zkumavky s 9 ml ster. destilované vody. Dobře promícháme! Tento postup opakujeme až k dosažení ředění 10"8. 3. Z ředění 10"6,10"7 a 10"8 vykápneme pomocí pipety 100 ul na povrch pevného média (obr. 1) a L-kličkou rozetřeme rovnoměrně po celém povrchu pevného média. 4. Kultivujeme při teplotě 25 °C po dobu 1 týdne. -2/42- 5. K hodnocení vybereme nej vhodnější ředění (20 - 200 kolonií na misce) a spočítáme kolonie 6. Vypočítáme hodnotu CFU (Colony Forming Unit) v 1 g vzorku. Výpočet: Celkový počet kolonií vynásobíme ředěním a 10ti (pipetovali jsme 0,1 ml na misku). Celkový počet mikroorganismů .V na g vzorku se vypočte podle vztahu VC N =—---— součet všech kolonií spočítaných na vybraných plotnách, objem inokula aplikovaného na misku v ml. počet ploten použitých pro vypočet z pivního ředění, počet ploten použitých pro výpočet z druhého ředění, faktor prvního pro výpočet použitého ředění. Úkoly: Proveďte rodovou či druhovou identifikaci izolátů. Vypočítejte hodnotu CFU. -3/42- -4/42- -5/42- 3. Izolace mikroskopických hub sterem z prostředí Materiál: stěr z prostředí (např. okenní rám, žaluzie, odpadkový koš, klávesnice počítače, aj.) Pomůcky: lx sterilní vatový tampon, 2x Petriho miska s MA 2% (agar se sladovým extraktem + chloramfenikol), termostat na 25 °C Pracovní postup: 1. Sterilní vatový tampón zvlhčíme přetřením povrchu agaru. 2. Sterilním vatovým tampónem přetřeme odběrové místo. 3. Sterilním vatovým tampónem přetřeme celou plochu Petriho misky s agarem. 4. Kultivujeme 7 dnů při teplotě 25 °C. Úkoly: Podle identifikačního klíče proveďte rodovou či druhovou identifikaci. 4. Izolace vodních hyfomycet Materiál: rostlinný materiál (opadané listí, větvičky na vodní hladině) odebraný z vodního toku do plastového sáčku Pomůcky: kádinka (zavařovací láhev), Petriho miska se sterilní dest. vodou, pinzeta, termostat na 15 °C Pracovní postup: 1. Materiál necháme v laboratoři promývat 1 hod. pod tekoucí vodou. 2. Části rostlinného materiálu přemístíme do Petriho misky s destilovanou vodou. 3. Kultivujeme několik dní při 15 °C a pod mikroskopem kontrolujeme tvorbu konidií. 4. Provedeme identifikaci dle klíče Úkoly: Podle identifikačního klíče proveďte rodovou či druhovou identifikaci. -6/42- 5. Izolace mikroskopických hub z osiva (seed born fungi) Materiál: obilky pšenice Pomůcky: 2% roztok dezinfekčního přípravku SAVO, minutky, sterilní detilovaná voda, sterilní pinzeta, sterilní Petriho miska s filtračním papírem nebo kultivační médium (PDA - potato dextrose agar) Pracovní postup: 1. Provedeme povrchovou dezinfekci vložením 5 obilek do 0,4 % NaClO (SAVO) na dobu 4 minut. 2. Poté osivo třikrát opláchneme sterilní destilovanou vodou. 3. Sterilní pinzetou rozmístíme obilky na povrch PDA (viz. schéma). 4. Kultivujeme ve tmě, při teplotě 25 °C po dobu deseti dnů. 5. Mikroskopické hodnocení Úkoly: Proveďte rodovou či druhovou identifikaci. 6. Příprava čisté kultury Materiál: Petriho misky se smíšenou kulturou Pomůcky: preparační jehla, Petriho miska s médiem, termostat na 25 °C Pracovní postup: 1. Vyžíhanou preparační jehlou přeneseme část mycelia nebo spor na agarovou plotnu nebo do sterilní vody ve zkumavce k získání suspenze, kterou můžeme dále ředit a poté vysévat na agarovou plotnu. 2. Kultivujeme 7 dnů při teplotě 25 °C. -7/42- 7. Příprava mikrokultury (sklíčkové kultury) Materiál: Petriho misky s kulturou vláknité houby Pomůcky: preparační jehla, Petriho miska s vhodným kultivačním médiem (Malt Extrakt Agar nebo Sabouraudův glukozový agar), sterilní pinzeta, sterilní destilovaná voda, sterilní krycí a podložní skla, sterilní Petriho miska (vlhká komůrka). 1. Z tenké vrstvy kultivačního média připravíme bloček o velikosti lxl cm. 2. Bloček přeneseme na sterilní podložní sklo umístěné ve vlhké komůrce. 3. Vpichem do čtyř stran naočkujeme kulturu a překryjeme krycím sklem. 4. Kultivujeme 2 - 5 dní při teplotě 25 °C. 5. Průběžně sledujeme růst suchým objektivem při zvětšení 60x - 450x. Pracovní postup: -8/42- 8. Identifikace vláknitých hub rodu Asoersillus Materiál: Petriho misky s kulturou Pomůcky: preparační jehla, Petriho miska s CYA (Czapkův agar s kvasničným extraktem), MEA (Agar se sladovým extraktem), CY20S (Czapkův agar s kvasničným extraktem a 20% sacharosy), termostat Pracovní postup: 7. Povrch příslušných médií inokulujeme konidiemi vláknité houby formou vpichu na třech místech tvořících vrcholy rovnoramenného trojúhelníka (body mají být vzdáleny asi 3 cm od kraje misky). Aby se spory při očkování nerozptýlily po celé půdě, očkujeme misky zespodu, otočené dnem vzhůru. 8. Kultivujeme 7 dnů při teplotě 25 a 37 °C._ _ Schéma inokulace: Hodnocení: po 7 dnech kultivace provedeme vyhodnocení růstu vláknitých hub. Sledujeme: znaky makroskopické • rychlost růstu • charakter povrchu kolonií • barvu kolonie • barvu spodní strany kolonie • přítomnost pigmentu difundují čího do agaru • přítomnost a barvu výpotku (exudát) • přítomnost zvláštních útvarů viditelných okem (plodničky, sklerocia, aj.) • charakteristický zápach. -9/42- V hodnocení vždy uvedeme stáří kultury a použitou kultivační půdu, neboť různé půdy mnohdy modifikují a značně mění charakteristické znaky (jak makroskopické, tak mikroskopické). Čisté kultury připravujeme zpravidla na půdě, na které je popis rodu autorem uveden. znaky mikroskopické Ke zjištění mikroskopických znaků nutných pro identifikaci vláknitých hub potřebujeme kromě mikroskopu i binokulární lupu. Pod lupou prohlédneme větší struktury (charakter mycelia, sklerocií, plodniček apod.), pro studium dalších struktur, na nichž je založena identifikace, připravíme mikroskopický preparát. Jeho příprava a správné posouzení a zhodnocení je mimořádně důležité, neboť morfologické znaky u vláknitých hub jsou základním diagnostickým kritériem při určování rodů a druhů. Identifikace do rodu či druhu na základě makroskopických a mikroskopických morfologických znaků se provádí podle klíčů vypracovaných pro určité taxonomické skupiny. ■ ' ■, i ■ ■ - ■ • iiuuc - ľcus UniSeriaini DISeriaini konidiátohkvicesloupcovitč Úkoly: Popište veškeré znaky do identifikačního protokolu Podle identifikačního klíče proveďte druhovou identifikaci. -10/42- Příloha VI Aspergillus ' ooc sek fialidy . ; - prim Fialidy - ~» / mfchýřek ------ konidiofor ......„ 1 O/ir. 7. Kuiiiiiiiifiiry u rodu \ -|» u-illu ipn.lli' 1 (n I >i-I'll a 1 -11 r «Ilm ľ) a uliniiľľiii kol in In >n nu h ji'ilniiil línii n i rlalid.'i iikmiŕiuií koniiüoforu «■ ilvAinii "llll.IN I lllllll OAr. í. „HüIIp cell*" (prázdno bunky) li nulu AH|inr|{illuH (m iK i Obr. Ml.nl i |ili«lnn'Ua u nulu AapergiL- lllH (pudlu \l \i I Obr. 4. povrchu zraló pliidniŕky n nulu An|M'i'KÍlliiH (pudlo Arxcl Obr. í. V'roeku u rudu AitpcŕHillux (pudlo Arxo) Obr. (!. Ankr, I, Kniudinforv u roilu I'oiiicillium (Jtiwrl ieillata Symmetrica) (podle Ra- (jmillc Knppra a Thoma) |htii it Thoina) a MmiiivKi't ioilhilu, ft Hivcj'l ifilliitn Ohr.-i. Kuniilinfoiy u rodu Penieillium \' \ iiiiiit'i ricn (AHvinnwtric.it Divaricate) {portli* Rapcra OI>r. 'J. Kotiidiofor ii mihi IVnii'illium n Thoma) -14/42- podrod Aspergilloides podrod Pemcillium ci—diofor monoverticiláíní konidiofor asymetricky větvený terverticiláíní podrod Bivertícillium konidiofor biverticilátně symetrický podrod t urcctum konidiofor divarikátni Jbr. 3 - Schemalicicá znázorněni typů konidioforů u rodu Pemcillium 10. Identifikace vláknitých hub rodu Fusarium MONHHIH.KK» slili kil ll\ l UOlMi USAliHM Materiál: Petriho miska s kulturou na PDA (bramborodextrozový agar) Hodnocení: po 10 dnech kultivace při 25 °C L znaky makroskopické, které určime z charakteru růstu • rychlost růstu • barvu kolonie • barvu spodní strany kolonie • přítomnost zvláštních útvarů viditelných okem (sporodochia, sklerocia) II. znaky mikroskopické, které zjistíme pomoci nativního preparátu • makrokonidie - tvar bazálni a apikální buňky, mikrokonidie, chlan • typ fialid (monofialidy, polyfialidy) Úkoly: Popište veškeré znaky do identifikačního protokolu Proveďte druhovou identifikace. ípoTIHltK'hlUm n* agátu ...__. llŕťflMUjIliU ;ivMiiitiiiiiiip inimiiiitnii f piiiiiiHHv [in ngaiu T-:■• r-/ (xilvhlaMiťkŕ fmluiy Fusarium culmorum mladá makrokonidie makrokonidie fialida rozvětvený konidiofor KÉ €Pq ivofka míkroVoniJie mc/ukimkliť mikfokomjie chlíniyJo»por>' skici cítia 11. Identifikace vláknitých hub řádu Mucorales Materiál: Petriho miska s kulturou Hodnocení: III. znaky makroskopické, které určime z charakteru růstu IV. znaky mikroskopické, které zjistíme pomoci nativního preparátů Úkoly: Popište veškeré mikroskopické znaky. Proveďte identifikaci do rodu. Charakteristické znaky řádu Mucorales Zástupci tohoto řádu vytváří řídce vatovité nebo plstnaté vzdušné mycelium velmi rychle rostoucí. Stélku těchto hub tvoří převážně mnohojaderné mycelium bez přehrádek a proto je zvláště u mladého mycelia dobře pozorovatelné proudění plazmy. Přepážky se vyskytují pravidelně pod rozmnožovacími orgány a ve stáří nepravidelně v průběhu mycelia. Pro rozlišení rodů a druhů řádu Mucorales se používají především znaky nepohlavního rozmnožování, které se uskutečňuje sporangiosporami vznikajícími ve sporangiích vyrůstajících na zvláštních vláknech - sporangioforech. Mucor - sporangiofory jsou ukončeny sporangii bez apofýzy, s kolumelou kulovitou, oválnou nebo hruškovitou. Rhizopus - sporangiofory se tvoří obvykle ve svazcích a nebývají větvené. Vznikají na výhoncích (stolonech), které tvoří velmi často na pevném podkladu rozvětvené, tmavě hnědé rhizoidy. Kolumela má vyvinutou apofýzu. Po prasknutí sporangiální stěny se kolumela s apofýzou kloboukovitě obrací. Rhizomucor - sporangiofory bývají větvené. Přítomny stolony a hnědé rhizoidy. Absidia - sporangiofory vyrůstají ve svazcích na výhoncích s rhizoidy. Kolumela kuželovitá, často má na vrcholu papilu nebo ostřejší výčnělek. Sporangiofor přechází do sporangia širokou apofýzou. Příloha II Mucorales Uhr. t. 'ľviH'ÍMI /.y ^i mpi iry n MiiľuľiilľH <<"ÍK) u h i > i k li 111 kiiiioľi I'Im i ti mi i n im myi'nlii, h 7-VK"tu, <• yyiŕiH|)nrii Obr. 2. Miin)iiw|Hiľiľkó Mnunnumni n kulu- iik'Iiiii u r. MniMíľ (iiriK.) Obr. 3. ("'list Rpoimngiofoni *r> iponuigio- 11 ■ 1111 u nulu TllitliiMliliilin l| "II /...-in Ohr. 4. S]irtľiiii^jnin h ii|Mifv/.ou a kulu-tiinlun u nulu AImiiIih [mii^.i Ohr. S. I.'I.'N" I ■ ■ r n i Vf^l'lHl IVIlíľll lnui." I. u MiK'iiriili'H (■ inj- ') u olifí hufikii, h gama, r |iuéfcí liiinky Ohr. H. Hn/.Vm-m k<.ihm- h|ifiiri( h iiiťľiiHIluľlinKll i 'i ir Ohr. 7. K|ioriiklftiliiini h liiilíiliiini n h kutu iIk'IIii u Mm.......I< (|imllo Arxn) 12. Nativní preparát: Princip: mikroskopické morfologické znaky vláknitých hub sledujeme v nativním preparátu. Protože se však jejich vlákna špatně smáčejí a v preparátu často bývají vzduchové bubliny, je lépe použít místo vody 10 až 20% vodný roztok glycerolu, který nevysychá tak rychle. Místo glycerolu lze použít i roztok laktofenolu nebo kyselinu mléčnou. Materiál: kultury vláknitých hub Pomůcky: podložní a krycí sklo, preparační jehla, kyselina mléčná Pracovní postup: 1. Na podložní sklo naneseme kapku kyseliny mléčné. 2. Sterilní preparační jehlou přeneseme z kolonie mikromycety malé množství mycelia s fruktifikačními orgány do kapky kyseliny mléčné (nejlépe dvěma preparačními jehlami). U kultur silně sporulujících odebíráme mycelium na rozhraní mezi zbarvenou částí kolonie a bílým okrajem, aby v preparátu nebylo příliš mnoho konidií. Mycelium neroztíráme, abychom nepoškodili fruktifikační orgány - pouze jehlami uvolníme jednotlivá vlákna do kapaliny. 3. Opatrně přikryjeme krycím sklem (nepřitiskujeme!) a přebytečnou kapalinu odsajeme ze strany filtračním papírem. 4. Preparát bez další úpravy prohlížíme suchým objektivem, nejprve slabým zvětšením (objektiv lOx), postupně pak silnějším zvětšením (objektiv 40x a lOOx) u hyalinních mikromycet s fázovým kontrastem Sledujeme: • charakter mycelia (šířku vláken, barvu a strukturu mycelia, přepážky (septa) - přítomnost a rozložení, způsob větvení) • charakter, způsob tvoření (konidiogeneze) a uspořádání fruktifikačních orgánů (např. sporangiofory, konidiofory, sporangia, kolumela, fialidy, konidie, zygospory, askospory aj.) • přítomnost a charakter jiných útvarů (chlamydospory). Mikroskopování Říše: FUNGI Oddělení: MUCOROMYCOTA Pododdělení: MUCOROMYCOTINA Třída: MUCOROMYCETES Řád: MUCORALES - mnohojaderné coenocytické mycelium, přehrádky se tvoří pro oddělení rozmnožovacích orgánů nebo ve starších myceliích - sporangia vznikají na větvených či nevětvených sporangioforech, jsou většinou mnohosporová (až 1000 spor), u odvozenějších typů vznikají sporangia s malým počtem spor (až jednosporové - nesprávně označované za "konidii") - zygospora vzniká při pohlavním rozmnožování splynutím dvou různých gametangií complete cross-wall přepážka - Mucoromycotina Rod Mucor - sporangiofory větvené či nevětvené, bez rhizoidů a stolonů, ukončeny mnohosporovými sporangii bez apofýzy, s kolumelou kulovitou, oválnou nebo hruškovitou a. sympodiálně větvený circinátní sporangiofory b. kulovitá kolumela c. sporangiospory Rod Rhizopus - sporangiofory se tvoří obvykle ve svazcích a nebývají větvené. Vznikají na stolonech (výhoncích), které tvoří velmi často na pevném podkladu rozvětvené, tmavě hnědé rhizoidy. Kolumela má vyvinutou apofýzu (nálevkovité rozšíření sporangioforu pod sporangiem). Po prasknutí sporangiální stěny se kolumela s apofýzou kloboukovitě obrací. a. nevětvené sporangiofory s rhizoidy b. kolumela s apofýzou c. sporangiospory d. chlamydospory e. rhizoidy Rod Absidia a. větvené sporangiofory b. kolumela kuželovitá s 1 nebo několika výběžky a apofýzou c. obří buňky d. sporangiospory rhizoidy a stolony nezřetelné Rod Zygorhynchus - vznik zygospory 2-655 Zygorhynchus moelleti F1088 ^~^ F1091 F1090 Rod Cunninghamella - větvené sporangiofory ukončené jednosporovými sporangii (sporangioly), rhizoidy vyvinuté, stolony chybí a. větvený sporangiofor zakončený sporogenními hlavicemi b. sporangioly (jednosporová sporangia) c. zygospora Říše: FUNGI Oddělení: ASCOMYCOTA vegetativní stélku tvoří přehrádkované mycelium nebo pučivé buňky či pseudomycelium tvorba sept je centripetální, začíná u stěny hyf a pokračuje ke středu kde ponechá volný pór přepážka - Ascomycota přepážka - Saccharomycetes central septal pore " (50-500 nm diam) • Woronin bodies Rozmnožování: pohlavní i nepohlavní nebo jen nepohlavní - stádium, kdy houba vytváří nepohlavní mitospory, se nazývá stádium imperfektní (anamorfa) - stádium, kdy houba vytváří pohlavní meiospory, se nazývá stádium perfektní (teleomorfa) Nepohlavní rozmnožování - nejjednodušším způsobem je fragmentace hyf - buňky vznikající exogénne na specializovaných hyfách - konidioforech nazýváme konidie - buňky, které dávají vznik konidiím nazýváme konidiogenní buňky Základní typy konidiogeneze (vzniku konidií): 1. Thalická: již předem vytvořené buňky hyf se rozdělí přehrádkami a rozpadnou se na jednotlivé části. K formování definitivního tvaru dochází po oddělení. a) Thalicko - arthrická: arthrokonidie b) Holothalická: thalokonidie (thalokonidiemi jsou v jistém smyslu i chlamydospory - tlustostěnné přetrvávající buňky vznikající na myceliu) 2. Blastická: konidie se formuje dříve než je oddělena přepážkou od konidiogenní buňky a) Holoblastická - účast všech vrstev buněčné stěny a) synchronní - produkce více konidií na měchýřku b) sympodiální - proliferace konidiogenní buňky b) Enteroblastická - vnější stěna se protrhne, konidii utváří vnitřní vrstva a) tretická - vznik porokonidií, často s výraznou jizvou na konidiogenní buňce b) fialidická - konidiogenní buňky fialidy c) annelidická - konidiogenní buňky anelidy (límeček) Geotrichum candidum- arthrokonidie v rozpadajících se řetízcích Microsporum gypseum - thalokonidie (makrokonidie a mikrokonidie) 2-321 Microsporum gypseum Geomyces yannorum — holothalická konidiogeneze Botrytis cinerea — holoblastická., synchronní konidiogeneze 2-09É Clirysosporiam punnt/rum Rod Penicillium - enteroblastická, fialidická kon. Rod Paecilomyces_- konidiofory méně pravidelně větvené, fialidy protáhlé v dlouhý krček, konidie Rod Aspergillus - enteroblastická, fialidická kon Rod Fusarium - enteroblastická, fialidická kon 1. monofialidy 2. polyfialidy 3. makrokonidie 4. mikrokonidie 5. chlamydospory 6. sporodochium (palisáda konidioforů v ložisku na povrchu substrátu) Rod Trichoderma - enteroblastická, fialidická kon. Rod Trichothecium - blastická, retrogresivní Rod Stachybotrys - enteroblastická, fialidická kon. Rod Acremonium - enteroblastická, fialidická kon., tvorba synnemat, fialidy většinou jednotlivé, k vrcholu se zužující (jehlicovité), septum na bázi, konidie jednobuněčné, hladké, hyalinní v řetízcích či hlavicích. Phoma linsam - pyknidy (kulovitý nebo lahvicovitý útvar s ostiolem, uvnitř vystlaný konidiofory, na nichž se tvoří konidie) - nepohlavní rozmnožování Pohlavní rozmnožování - při pohlavním procesu vznikají plodnice (askomata) => v plodnicích pak dochází ke karyogamii v koncových buňkách tzv. askogenních hyfách - z nich vznikají vřecka - spory (askospory) vznikají ve vřecku (latinsky ascus, množné číslo asci) obvykle v počtu 8 v jednom vřecku Typy plodnic: 1) Askohymeniální typ - kleistothecium je uzavřená plodnice s vytvořenou stěnou, otvírá se rozpadem; vřecka nejsou nijak uspořádána (např. teleomorfa rodu Aspergillus) - perithecium je kulovitá nebo protáhlá plodnice s úzkým ústím (ostiolem) vystlaným perifýzami, vřecka jsou uspořádána v hymeniu, mezi nimi se tvoří sterilní hyfová zakončení - parafýzy (např. Chaetomium) - apothecium je miskovitá plodnice; vřecka jsou uspořádána v hymeniu na povrchu plodnice, parafýzy vytvořeny 2) Askolokulární typ - askostroma - v pseudoparenchymatickém útvaru se diferencují pohlavní orgány, askogenní hyfy a vřecka vrůstají do sekundárně vytvořené lyzogenní dutiny (lokulu) Chaetomium globosum A - perithecium B - zvlněná nevětvená vlákna (trichomy) C - vřecko (ascus) D - askospory Aspergillus nidulans - tvorba plodnic typu kleistothecium měchýřek Emericella nidulans, anamorfa Aspergillus nidulans fial id y mefculy konidie askospory luille cells" Eurotium amstelodami anamorfa Aspergillus vitis vrecka konidie fialidy askospory a vrecko stopka — konidiofor Použitá literatura: 1. Váňa, J.: Systém a vývoj hub a houbových organismů. Karolinum, Praha, 1996. 2. MycoBank, http://www.mycobank.org/ 3. De Hoog G.S.: et al.: Atlas of clinical fungi. Utrecht, Reus, 2000. 4. P.W. Crous, G.J.M. Verkley, J.Z. Groenewald, R.A. Samson. CBS Laboratory Manual Series 1. Fungal Biodiversity. CBS, Utrecht, 2009 5. https:^otany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.p 6. http: //old. vscht. cz/ob sah/fakulty/fpbt/o statni/miniatlas/mikr. htm MEDIA SAB - Sabouraudův agar s glukózou glukóza 40 g/l pepton 10 g/l agar 15 g/l pH 6,9 MA 2% - agar se sladovým extraktem Malt extrakt 20,0 g/l agar 20,0 g/l pH5.6 MA 0,5 % - agar se sladovým extraktem Malt extrakt 5,0 g/l agar 20,0 g/l pH5.6 Vodní agar destilovaná voda 1000 ml agar 20,0 g/l Půdní agar půdní extrakt 1000 ml agar 20,0 g/l Půdní extrakt - 500 g půdy vařit 1 hodinu v 1200 ml vody, přefiltrovat přes filtrační papír a doplnit na 1000 ml. /pH 6-6,5/ pH 6,6 - 6,8. OA- Ovesný Agar ovesné vločky 30 g/l agar 20 g/l Ovesné vločky vařit pozvolna 2 hodiny v 1 1 vody. Přefiltrovat přes gázu, doplnit do 1 litru. Přidat agar. SEA - Půdní agar s glukosou a bengálskou červení půdní extrakt 1000 ml glukóza 10,0g/l K2HPO4 l,0g/l NaN03 l,0g/l agar 20 g/l bengálska červeň 0,07 g/l Půdní extrakt - 500 g půdy vařit 1 hodinu v 1200 ml vody, přefiltrovat přes filtrační papír a doplnit na 1000 ml. /pH 6-6,5/ pH 6,6 - 6,8. DRBC (Agar s dichloranem, bengálskou červení a chloramfenikolem) pepton 5,0g/l glukóza 10,0g/l KH2PO4 l,0g/l MgS04 0,5g/l dichloran 0,002g/l bengálska červeň 0,025g/l agar 15,0g/l pH 5.6 ±0.2 Media pro identifikace rodu Aspergillus CYA (Czapkův agar s kvasničným extraktem) Pitt, 1973 K2HPO4 1 g/l Czapkův koncentrát* 10 ml/l kvasniční extrakt 5 g/l sacharóza 30 g/l agar 15 g/l pH 6 - 6,5 * Czapkův koncentrát: NaNC-3 30 g KC1 5 g MgS04.7H20 5 g FeS04.7H20 0,1 g ZnS04 0,1 g CuS04 0,05 g destilovaná voda 100 ml MEA (Agar se sladovým malt extrakt 20 g/l pepton 1 g/l glukóza 20g/l agar 20 g/l pH 5 - 5,5 extraktem) Blakeslee, 1915 CY20S (Czapkův agar s kvasničným extraktem a 20% sacharózy) Pitt et Hocking, 1985 K2HP04 1 g/l Czapkův koncentrát* 10 ml/l kvasniční extrakt 5 g/l sacharóza 200 g/l agar 20 g/l pH5,2 Media pro identifikace rodu Penicillium MEA (Agar se sladovým extraktem) Raper et Thom, 1949 malt extrakt 30 g/l pepton 1 g/l glukóza 20g/l ZnS04 0,01 g/l CuS04 0,005 g/l agar 20 g/l pH 5 - 5,5 CYA (Czapkův agar s kvasničným extraktem) Pitt, 1979 K2HPO4 1 g/l Czapkův koncentrát* 10 ml/l kvasniční extrakt 5 g/l sacharóza 30 g/l agar 15 g/l pH 6,3 ± 0,2 * Czapkův koncentrát: NaNC-3 30 g KC1 5 g MgS04.7H20 5 g FeS04.7H20 0,1 g ZnS04 0,1 g C11SO4 0,05 g destilovaná voda 100 ml CYAS (Czapkův agar s 5% NaCl) K2HPO4 1 g/l NaCl 50g/l Czapkův koncentrát* 10 ml/l kvasniční extrakt 5 g/l sacharóza 30 g/l agar 15 g/l pH 6,3 ± 0,2 YEA (Agar s kvasničním extraktem a sacharózou) Frisvad, 1989 kvasniční extrakt 20 g/l sacharóza 150 g/l agar 20 g/l MgS04.7H20 0,5 g/l ZnS04 0,01 g/l CuS04 0,005 g/l CREA (Kreatinový agar se sacharózou) Frisvad, 1985; 1993 K2HPO4 1,3 g/l MgS04.7H20 0,5 g/l FeS04.7H20 0,01 g/l KC1 0,5 g/l Z11SO4 0,01 g/l CuS04 0,005 g/l kreatin 3 g/l sacharóza 30 g/l bromkresolový purpur 0,05 g/l agar 15 g/l pH 8,0 ± 0,2 G25N (Glycerol nitrate agar) Pitt, 1973 K2HPO4 0,75 g Czapkův koncentrát* 7,5 ml kvasniční extrakt 3,7 g glycerol 250 g agar 12 g destilovaná voda 750 ml pH 6,3 ± 0,2 Ehrlichovo činidlo, Lund 1995 - pro testování přítomnosti mykotoxinů 4-dimethylamino- 2 g benzaldehyd ethanol 85 ml 10NHC1 15 ml 4-dimethylaminobenzaldehyd přidat do ethanolu, poté přidat HC1. Media pro identifikace rodu Fusarium PDA (Bramboro-dextrózový agar) Burgess, Liddell et Summerell, 1988 dextróza 20 g/l brambory 250 g/l agar 20 g/l Oloupané brambory nakrájet na kostky a přilít 1 1 vody, vařit 1 hodinu. Rozmixovat, přefiltrovat, doplnit vyvařenou vodu na 1000mi. PSA (Bramboro-sacharózový agar) Burgess, Liddell et Summerell, 1988 sacharóza 20 g/l brambory 300 g/l agar 15 g/l Oloupané brambory nakrájet na kostky a přilít 1 1 vody, vařit 1 hodinu. Rozmixovat, přefiltrovat, doplnit vyvařenou vodu na 1000mi. SNA (Syntetické živné médium) Gerlach et Nirenberg, 1982 K2HP04 1,0 g/l MgS04.7H20 0,5 g/l KN03 1,0 g/l KC1 0,5 g/l sacharóza 0,2 g/l glukóza 0,2 g/l agar 15 g/l Po ztuhnutí média v Petriho miskách položit na povrch agaru sterilní filtrační papír (cca 1 cm2). Stonek lupinu (Lupinus polyphyllus, vlčí bob mnoholistý) Zelené stonky lupinu se rozdělí na několik cm dlouhé části a vysterilizují v erlence s vodou. Sterilní kousky se přidají k ještě tekutému agarovému médiu v Petriho misce.