Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cell – ESC)
Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cell – EGC)
Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cell – ECC)
Kmenové buňky epiblastu (Epiblast stem cell – EpiSC)
Early-primitive ectoderm-like – EPL
Indukované pluripotentní kmenové buňky (Induced pluripotent stem cell – iPSC
(Multipotentní dospělé zárodečné kmenové buňky – maGSC)
Pluripotentní, odvozené kmenové buňky
ESC
ECC
EGC
(EPL)
EpiSC
iPSC
maGSC
[USEMAP]

looklike
Embryonální kmenové buňky
(Embryonic stem cell)
ESC
- jsou odvozené z vnitřní buněčné masy blastocysty
- fenotypem odpovídají přibližně buňkám vnitřní buněčné masy (mESC,
  ICM – inner cell mass) nebo epiblastu (hESC, EpiSC)
- jsou pluripotentní
- přirozeně neexistují, pouze in vitro
- jsou nesmrtelné
- mají schopnost si udržet stabilní genotyp (!?)
- po injikaci do imunitně tolerantního organismu tvoří teratomy
  (důkaz pluripotence)
- po injikaci do blastocysty mají schopnost tvořit kompletní chiméry
  (známo jen u mESC (ale také u mECC, mEGC a miPSC), důkaz pluripotence)
[USEMAP]

DBiologystr242 finito
Gilbert 1997 / Bílek 2004
Ontogeneze a diferenciační potenciál buněk vnitřní buněčné masy
[USEMAP]

mouseBl-1
ICM
Linie ES buněk na feederu MEF
4-5 dní
Fibroblastová výživná vrstva „feeder“- tvořená MEF
TE
Odstranění
 PEF
Homogenní populace ES buněk
Esd3_nguprav ES-D3-1uprav
Vyseknutí a disociace ICM
Izolace myších ES buněk
Upraveno podle Kroupová 2004
Imuno-chirurgie
6-8 ddnů IVF
[USEMAP]

TERATOM
CHIMÉRA
Organismus je směsí geneticky odlišných buněk / tkání / orgánů
Chimeričtí jedinci vzniklí injikací ES buněk (dárce) do blastocysty (příjemce)
jsou směsí geneticky odlišných buněk na ůrovni všech tkání, a tak také vytváří
pohlavní buňky s genotypem jak dárce, tak příjemce!
view_14
Nádor, který obsahuje buňky více jak jednoho zárodečného listu, většinou všech tří. Tyto buňky
mohou být fenotypu od časných stádií až po terminálně diferencované
Teratomy jsou typické nádory původem ze zárodečných buněk (ovariální a testikulární teratomy.
Teratomy jsou jak benigní, tak maligní (teratokarcinom)
Kmenové buňky teratokarcinomu = embryonální nádorové buňky
(Embryonal carcinoma (EC) cells)
Chimera
[USEMAP]

- ES buňky spontáně diferencují, v kultuře je třeba této diferenciaci zabránit
- diferenciace je často spojena s apoptózou
- vhodnými kultivačními podmínkami, lze diferenciaci inhibovat
- faktory inhibující diferenciaci ES buněk se částečně liší u různých druhů,
  ale existují výjimky i v rámci jednoho druhu!
ES
cell
mezoderm
+
entoderm
ektoderm
A
B
Obecný model inhibice diferenciace ES buněk
feeder
(výživná vrstva)
auto- a parakrinně působící factory
[USEMAP]

ES
cell
mezoderm
+
entoderm
ektoderm
LIF*
BMP-4
(BMP-2
/BMP-12
/FCS nebo SR*)
LIF – leukemia inhibitory factor
BMP-2,4,12 bone morphogenetic protein 2,4,12
FCS – fetal calf serum
Model inhibice diferenciace myších ES buněk
- existují i linie mES buněk nezávislé na LIF
- zdá se, že z LIF závislé linie, lze vyselektovat LIF nezávislou (!?)
- mES buňky pěstované bez „feederu“ ztrácí schopnost tvořit chiméry in vivo
- některé linie nelze bez „feederu“ pěstovat vůbec
Þvlastnosti mES buněk jsou ovlivněny genotypem imbredního kmene myší
    z kterého byly izolovány!
IGF, (FGF-4), Wnt
FGF-4 – fibroblast growth factor
SR – serum replacement
Feeder*
*ABSOLUTNÍ OPTIMUM
[USEMAP]

Růst a kultivace ES buněk
PROLIFERACE – DIFERENCIACE - APOTÓSA
Existence a charakter ES buněk je udržován kombinací účinků vnějších (extrinsic) a vnitřních
(intrinsic) faktorů. Vnější faktory si ES buňky částečně syntetizují samy, ale ve větší míře musí
být dodávány. Významným zdrojem těchto faktorů je výživná vrstva na které se ES buňky kultivují =
FEEDER. Vnitřní faktory si ES buňky nesou jako pozůstatek svého embryonálního původu.
FEEDER
- výživná vrstva = zdroj růstových faktorů (cytokiny, ECM, ..) a vhodný podklad
- nejčastěji se používají myší embryonální fibroblasty (13d p.c., MEF (PEF))
- bez „feederu“ z MEF = definované podmínky, ale horší ES buňky
- tendence používat druhově identické MEF = sníženi rizika přenosu virů, …
- MEF lze nahradit i jinými typy fibroblastů případně jinými buňkami
- MEF lze částečně nahradit komponenty ECM, specifickými cytokiny a přídavky,
  matrigelem,…, obecně definovanějšími preparáty
Důležitou komponentou kultivačního média pro ES jsou také nedefinované faktory séra,
které lze nahradit dodáváním specifických růstových faktorů. Často se také používá
tzv. Serum-replacement = lépe definovaná náhražka séra (patentované složení).
[USEMAP]

ES
cell
mezoderm
+
entoderm
ektoderm
FGF-2
Activin/Nodal
Noggin
Wnt
FCS?
Model inhibice diferenciace lidských ES buněk
+
MEF (feeder) nebo matrigel
IGF, ?, Wnt, FGF-2
?
FCS – obsahuje jak difereciaci indukující, tak diferenciaci inhibující faktory. Kvalitu FCS také
ovlivňuje titr protilátek a složek koplementu. FCS se liší mezi jednotlivými šaržemi = je třeba je
testovat. Lépe je používat náhrady FCS se sníženou koncentrací negativně působících látek na
kultivaci ES buněk, např. Serum-Replacement ( fy. Invitrogene-Gibco)
OPTIMUM???
[USEMAP]

Základní vnitřní faktory charakterizující / regulující ES buňky
(pluripotentní embryonální buňky)
Oct-4 (Oct-3/4, Oct-3, Pou5f1 – master of pluripotency)
- transkripční faktor, homeoprotein
- exprimuje se již u 2/4 (myš – aktivace transkripce) buněčného embrya
- ve stádiu moruly je jeho exprese výrazně zvýšena
- ve stádiu blastocysty je pouze v buňkách ICM
- později jeho exprese vymizí, zachovává se pouze v PGC (a později v
  zárodečných  buňkách)
- (nebyl nalezen u kuřat)
- reguluje expresi FGF-4 (Oct-4/Sox-2), PDGFa, ….
- v průběhu diferenciace za snížení jeho exprese odpovídá GCNF( germ cell
  nuclear factor, RA (retinoic acid),…
- v primitivním ektodermu je exprese Oct-4 podporována LRH-1 (liver receptor
  homologue 1)
- speciální varianta vzniklá alternativním sestřihem, se ale exprimuje i u MF
[USEMAP]

Sox2-20674-HMG_box-1gt0D
            Nanog
- transkripční faktor, homeoprotein
- jeho exprese vede k udržení vysoké hladiny Oct-4
- objevuje se již ve vnitřních buňkách moruly
- později se zdá být nezbytný zejména pro specifikaci PGC!
- (výskyt i u některých progersivních nádorů (?!))
                                                     Sox-2
- Transkripční faktor Sry-rodiny (sex-determining region Y protein)
- Kooperuje s Oct-4 na vlastní expresi
- V průběhu indukce neurální diferenciace se jeho exprese zvyšuje
Nanog-Homeobox-Protein-(NANOG)-98992
[USEMAP]

Boiani & Scholer 2005
[USEMAP]


Potencionální mechanismus účinků LIF
u mES buněk
LIF/gp130/LIFR
Jak2/STAT3
PI3K/Akt + Erk
Nanog
Klf4
Sox2
Tbx3
Oct4
Niwa 2009
090708
[USEMAP]

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is 1741-7007-8-125-1.jpg
Krüppel-like transcription factors and control of pluripotency.
Bourillot PY, Savatier P.
BMC Biol. 2010 Sep 27;8:125
[USEMAP]

a)standard protocol
b)3i/LIF protocol
c)2i/LIF protocol
LIF
(indukce STAT3)
SU5402
(inhibice FGF-R)
PD0325901 / PD184352
(inhibice Erk signalizace)
CHIR99021
 (inhibice GSK3, aktivace Wnt signalizace)
Alternativní kultivace mES protocol 2i/LIF, 3i/LIF
          (A. Smith laboratory)
[USEMAP]

Wnt a mES
Niwa 2011
[USEMAP]

Pan2006
Boyer2005
Regulace transkripce faktory Oct-4, Nanog a Sox-2
Předpokládaný model vzájemné regulace exprese FoxD3,
Nanog a Oct-4 u mES. FOxD3 není exprimován u hES.
Model vzájemné regulace Oct-4, Nanog a Sox-2 a některé
jimi řízené geny u hES.
Promotory genů
Proteiny
Vzájemná regulace Oct-4 a Nanog není dosud plně objasněna.
Je však již jasné, že Oct-4 řídí transkripci Nanog přímou vazbou
v jeho promotoru (společně se Sox-2), jak u mES tak hES.
Pro self-renewal ES buněk je klíčové zachovat rovnováhu
v hladinách Oct-4 a Nanog (viz. níže).
Promotorové sekvence
rozpoznávané Oct-4, Nanog
a Sox-2 u hES.
[USEMAP]

Figs2
Příklady vývojově významných genů pod kontrolou heterodimeru Oct4/Sox2
[USEMAP]

Zhou et al., 2007
Oct4/Sox2/Nanog zprostředkované regulace u mES buněk
[USEMAP]

Ztráta pluripotence u ES buněk v důsledku
deregulace rovnováhy mezi hladinou Oct-4 a Nanog
Chamber, 2004
Johnson 2006
[USEMAP]