ES BUŇKY a)myší ES (mES) x b) lidské ES (hES) (LIF / gp130* / STAT3 dependent) (LIF / gp130* / STAT3 independent) Toto rozdělení je pravděpodobně dáno možností některých živočišných druhů mít skrytou březost ve stádiu blastocysty (embryonální diapauza). Rao, 2004 [USEMAP] mESC PGC (h/m) EGC (h/m) gp130 signalling dependent / STAT3 somatické SC ?? pluripotent multipotent a méně embryonální diapauza (myš / lasicovití) hESC/mEpiSC mouse Signální dráha gp130 ->-> STAT3 ve vztahu k pluripotentním buňkám u člověka a myši Současné studie však ukazují, že za regulaci diapauzy je odpovědná zejména matka => u každé blastocysty lze navodit diapauzu !? (G.E. Ptak et al., PLOS One 2012) [USEMAP] Některé charakteristické znaky myších a lidských ES buněk mESxhES kopie [USEMAP] ‡Glykolipidy, § Keratan chondroitin sulfát proteoglycan, ITetraspannin transmembránové proteiny, AP – alkalická fosfatáza, EB – embryoidní tělísko, ESC – embryonální kmenové buňky, SSEA – vývojově specifický embryonální antigen (stage-specific embryonic antigen), TRA – antigen odmítnutí nádoru (tumor-rejection antigen), NR – nestudováno (not reported) [USEMAP] 773ÔÇô89_05_0001 + mES - hES / mEpiSC - mES + hES / mEpiSC Signální dráha TGFbeta / BMPs u ES buněk [USEMAP] Kmenové buňky epiblastu – EpiSC (Epiblast stem cell) Brons, 2007 & Tesar, 2007 [USEMAP] Kmenové buňky epiblastu – EpiSC (Epiblast stem cell) Brons, 2007 & Tesar, 2007 EpiSC - neintegrují se do moruly a blastocysty => rozdíl s mES - netvoří kompletní chiméry - nebyla detekována aktivní alkalická fosfatáza (AP) (mES, hES, EC, EG, PGC, mají aktivní AP) - EpiSC částečně vysvětlují rozdíly mezi mES a hES [USEMAP] Kmenové buňky epiblastu – EpiSC (Epiblast stem cell) Brons, 2007 & Tesar, 2007 [USEMAP] Gadue 2005 mES je možno reverzibilně převést na buňky připomínající buňky primitivního ektodermu tzv. EPL (early-primitive ectoderm-like) buňky. Tyto buňky již nemají podobně jako buňky primitivního ektodrmu schopnost tvořit buňky parietálního entodermu. Také některé jejich další schopnosti diferencovat, jsou oproti ES buňkám pozměněny (Pelton 2002) . EPL (+ FGF-5*) ES (- FGF-5*) +LIF - LIF + HepG2 buňkami kondiciované médium *EPL buňky jsou podobně jako buňky primitivního ektodermu exprimují FGF-5 na rozdíl od ES buněk, které exprimují zejména FGF-4 (platí pro myš) [USEMAP] Metylace DNA a kondenzace chromatinu u ES buněk Meshorer & Misteli 2006 j Epigenetika ES buněk [USEMAP] Proliferace ES buněk Stránky z sc S laskavým nedovolením z katalogu Santa Cruz Biotechnology, Inc. [USEMAP] sejmout0006 sejmout0005 - ES buňky relativně intenzivně proliferují (podobné nádorovým buňkám) - G1 fáze buněčného cyklu je krátká (u mES ~ 1.5 h), zdá se, že chybí G1-checkpoint* - velké procento buněk je v S fázi buněčného cyklu (mES > 60%, hES > 50%) - doubling time mES ~ 10-12h, hES ~ 18-20h - specifická charakteristika regulace buněčného cyklu (odolnost k p16, nízká hladina cyklinů D, vysoká hladina cyklinu E, není potřeba proteinů rodiny Rb) - inhibice proliferace, prodloužení G1 fáze (suboptimální podmínky) vede k diferenciaci a apoptóse, diferenciace a apoptósa ES buněk, však nemusí vést ke snížení proliferace jako takové *tzv. kontrolní bod R, o průchodu tímto bodem rozhodují zejména mechanismy rozpoznávající itegritu/neporušenost genomu, buňky s požkozenou DNA jsou za normálních okolností v tomto bodě zastaveny. Porucha tohoto kontrolního mechanismu je typická pro nádorové buňky. [USEMAP] A short G1 phase is an intrinsic determinant of naïve embryonic stem cell pluripotency. Coronado D, Godet M, Bourillot PY, Tapponnier Y, Bernat A, Petit M, Afanassieff M, Markossian S, Malashicheva A, Iacone R, Anastassiadis K, Savatier P. Stem Cell Res. 2013 Jan;10(1):118-31 Zpomalení proliferace a prodloužení G1 fáze vede k diferenciaci ES buněk [USEMAP] Rozdílné proporce v jednotlivých fázích cyklu u časných embryonálních buněk [USEMAP] Apoptická kontrola nestability karyotypu a ES buňky Checkpoint-apoptosis.... of karyotipic instability. Mantel, 2007 - u zdravých somatických buněk při poruchách mitotického aparátu během jejich dělení a tak vznikající chyby v mitóse vedou k jejich přechodu do senescentního stavu nebo k indukci apoptósy - ES buňky mají zvýšenou toleranci k poruchám mitózy, menší citlivost tzv. SAC (SAC – splindle assembly checkpoint) => akumulace aneuploidních a polyploidních buněk v populaci - indukcí diferenciace lze tyto buňky částečně eliminovat (apoptósa) - tetraploidní buňky (blastomery) mohou tvořit jen trofoblast => G1 MTA/tetraploidity checkpoint => využití při tvorbě embryí plně ES původu [USEMAP] Příklad nárůstu apoptósy s diferenciací a požkozeným mitotickým aparátem ES – embryonální kmenové buňky EB – ES diferencovanou formou embryoidních tělísek Noc/NOC – nocodazol PAC - paclitaxel [USEMAP] Chromosomální stabilita a ES buňky Draper, 2004; Hanson, 2005 - dlouhodobá kultivace ES buněk vede k selekci odolnejších klonů a subpopulací - menší responzivnost na vnější signály, rychlejší proliferace, menší nároky na kultivaci, klíčové znaky často zachovány (Oct-4, Nanog, příslušné SSEA,...) - u myší snížena schopnost tvorby chimér a zéjména germline u těchto chimér - často spojeno s genetickou manipulací (knock-out, -in ES linie) - nestabilita chromosómů, polyploidie, trizomie, zlomy a přeskupování genů => adaptace na in vitro podmínky - hES, primární je trizomie chromozomu 12 nebo 17, vzácněji chromosomu 14 a 20 - často dochází i ke zdvojení dlouhého raménka chromosomu 17 a k translokaci této kopie na dlouhé raménko chromosomu 6 => posílení exprese genů na chromosomu 17 (Survivin – proti apoptóse, STAT3 – self-renewal mES a nadbytek u většiny nádorů, GRB2 a 7 (growth factor receptor bound protein, viz. signální transdukce)) - na chromosomu 12 je lokalizován nanog (Nanog) - časté i změny malých oblastí na chromosomech 1, 8, 18 a 20 - u mES se jedná o změny zejména chromosomů 8 a 11 (myší chromosom 11 je z části ekvivalentní k lidskému chromosomu 17) [USEMAP] Jak vypadá správná ES buňka? Jsou všechny ES buňky v kultuře stejné? Davey2006_40_0001 Davey, 2006 Fortunel, 2003 LIF -> STAT3 aktivita u mES buněk Microarray analýza exprese „stemness“ genů pokračování pokračování [USEMAP] Model narůstající heterogenity v rostoucí kolonii ES buněk za dodržení známých optimálních kultivačních podmínek růst kolonie ES buněk Buňky odpovídající buňkám ICM/epiblastu Časného neuroektodermu Buňky primitivního entodermu (morphologicky navíc tvoří také malá granula) 30<* 50<* 100<* *orientační počet buněk v kolonii epiblast ICM blastocoel blastocoel trofoectoderm Myší ES Lidské ES vývoj blastocysty [USEMAP] 674 1389 475 332 343 204 637 Ramalho-Santos Fortunel Ivanova 356 275 2 6 23 1 201 ESC x NPC + RPC/HSC ESC Fortunel, 2003 10 58 685 286 30 157 792 ESC + NPC 798 1744 337 238 54 267 1341 NPC Variabilita v analýze transkripčního profilu u ES buněk (ESC), neurálních progenitorů (NPC), progenitorů retiny (RPC) a hematopoetických kmenových buněk (HSC) u myši. Tři pracovní skupiny, jedna metoda. [USEMAP] Existují geny kmenovosti, tzv. „stemness geny“ ? Vývojově specifické geny => potenciál buněk Příslušné signální dráhy, specifický patern jejich aktivit => regulace diferenciace, proliferace, sebeobnovy + [USEMAP] VYUŽITÍ ES BUNĚK 1.Biologický a biomedicínský výzkum -Příprava geneticky modifikovaných organismů -Studium mechanismů časné embryogeneze / diferenciace -Studium mechanismů kancerogeneze -Studium embryotoxicity -Testování farmak 2. Lékařství - Buněčné a tkáňové terapie - Příprava biologicky aktivních preparátů - Nosiče biologicky aktivních látek (pathotaxe) [USEMAP] Pro vytvoření linie GMO je potřeba, aby požadovaná genetická modifikace byly obsažena i v pohlavních buňkách. Tuto modifikaci je tedy potřeba provést na buňkách toti- nebo pluripotentních. •Náhodným nebo cíleným(?) vložením požadované DNA do zygoty •Náhodným nebo cíleným vložením požadované DNA do ES buněk Příprava geneticky modifikovaných organismů - GMO - Díky prakticky neomezené možnosti kultivace ES buněk, lze mít prováděnou genetickou modifikace plně pod kontrolou, a také ji můžeme velice přesně naplánovat!!! - ES buňky jsou pluripotentní, po zpětné injikaci do blastocysty a vložení této blastocysty do dělohy pseudo-pregnantní myši, blastocysta pokračuje ve vývoji a vzniklý jedinec je chimérou buněk původni ICM a injikovaných ES na ůrovni všech tkání, tedy i zárodečné. [USEMAP] Příprava KO/I myší [USEMAP] ivf scnt ES buňky v buněčné terapii [USEMAP] Model regenerace poškozené hematopoesy v důsledku mutace Rag2-/- s použitím ES buněk, genetických manipulací a jaderného reprogramování Rideout, 2002 [USEMAP] Diferenciace ES buněk a) In vivo - teratomy: injikace suspenze ES buněk do vaskularizované tkáně imunitně tolerantního zvířete, popřípadě do zvířete s farmakologicky potlačenou imunitní odpovědí - chiméry: injikace ES buněk do blastocysty, navrácení takové blastocysty do pseudo-pregnantní myši = vznik chimerického jedince b) In vitro - metodiky korespondující s ontogenezí - metodiky získané empiricky (kopírující ontogenezi?) Musí buňka diferencující z ES buňky vždy kopírovat ontogenezi aby dosáhla určitého stavu? [USEMAP] In vitro diferenciace ES buněk a)Embryoidní tělíska (Embryoid bodies - EB) +jednoduché, více buněčných typů + tolerující genotyp - špatně definované podmínky - b)V monovrstvě + dobře definovné podmínky - malá efektivita (většinou) - může být silně závislé na genotypu kultivace selekce indukce Rathjen 1998 / Bílek 2004 [USEMAP] Loebel, 2003 Úloha specifických růstových faktorů v ontogenezi myši [USEMAP] Loebel, 2003 Příklady diferenciace myších ES buněk kombinací typu jejich kultivace a specifických růstových faktorů s porovnáním úlohy těchto faktorů v myší ontogenezi pokračování Schuldiner, 2000 Příklad účinků jednotlivých specifických růstových faktorů na indukci diferenciace u lidských ES buněk v kombinaci s tvorbou embryoidních tělísek [USEMAP] Guasch, 2005 [USEMAP] Barberi 2003 Příklad difernciace ES buněk do různých typů neurálních buněk NSC – neural stem cell, DA/Ser/GABA – dopaminergní/serotonergní/gabanergní neurony, MN - motoneurony [USEMAP] Příklady diferenciace lidských pluripotentních buněk do kardiomyocytů [USEMAP] esc SOUČASNÉ PROBLÉMY S VYUŽITÍM ES BUNĚK V TERAPII [USEMAP] - hES se nedaří dlouhodobě kultivovat beze změn v genotypu / fenotypu - - dlouhodobá kultivace za sub-optimálních podmínek vede k dosud neznámým, epigenetickým změnám snižujícím schopnost pluripotence (ireverzibilními i pro cytoplasmu zygoty, Amano 2006) - dosud není spolehlivě vyřešen potencionální vznik teratomů - - biologie a diferenciační potenciál ES buněk nejsou dosud dobře prozkoumány - kultivace ES buněk je stále závislá na nedefinovaných faktorech Částečně vyřešeno za využití iPSC: - - vliv pohlaví, inaktivace X chromosomu x aktivace genů na Y chromosomu (variabilita v odpovědí na stimuly diferenciace, stabilitu vlastností..) - etika získávání nových lidských ES linií (různé státy, různé pohledy na věc) - finance, přes velice atraktivní potenciál, který v sobě ES buňky mají, není jisté, jestli současná společnost bude mít dost prostředků na jejich využití např. v buněčné terapii [USEMAP]