Primordiální zárodečné buňky – PGC (primordial germ cell) - PGC se u myši objevují již 6 dpc, pravděpodobně je jejich vznik indukovaný v průběhu gastrulace, a to vnějšími signály, zejména BMP (na rozdíl od žab, Drosophily a C. elegans). - 6 – 7.5 dpc migrují vně vlastní embryo, později (8.5 dpc <) migrují podél zadního střeva embrya do vytvořené zárodečné lišty. - PGC zanikají po usazení v zárodečné liště (10-13 dpc u myši), stávají se z nich zárodečné buňky. Prodělají ještě 2-3 mitózy a u samců vznikají prospermatogonie zastavené v G0/G1 fázi mitózy. U samic vstupují do meiotické profáze (obojí > 12.5 dpc). - Podobně jako ICM a ES buňky mají vysokou hladinu alkalické fosfatázy (ale ne TNAP, ale GCAP/TNAP), také exprimují Oct4, Nanog, .. - Významné (pro specifikaci) jsou zdá se zejména Stella, Fragilis, Nanog,…. - PGC nejsou pluripotentní, jsou unipotentní! - PGC mají omezený počet dělení, u myši napočítáno kolem 1000 buněk, rozdíly v závislosti na imbrední lini (případně metodě J) [USEMAP] Další klíčové geny ve specifikaci PGC Stella (DPPA – developmental pluripotent associated 3) Od oocytu (maternalní) po epiblast, později jen u PGC, podílí se na udržení jejich fenotypu, po jejich usazení v zárodečné liště jeho exprese vymizí. Také u ES buněk a některých nádorů. Represor transkripce. PCG protein, regulace methylace genomu. Fragilis (IFITM3 – Interferon induced transmembrane protein 3) Z rodiny IFN indukovaných genů, je silně exprimován při formování PGC, s jejich migrací jeho exprese klesá. Transmembránový protein, narušuje intracelulární metabolismus cholesterolu a tím modifikuje vlastnosti buněčných membrán. [USEMAP] Pages from Pesce1998-Oct4development_Page_1_Image_0001 Cyklus zárodečných buněk u myši [USEMAP] PGCs Exprese Fragilis mezi 6 – 7 dpc Exprese Oct-4 v PGC usazených v zárodečné liště PGC primordiální zárodečné buňky [USEMAP] Hayashi-1 Hayashi, 2007 Mechanismus vzniku PGC [USEMAP] Hayashi-2 Hayashi, 2007 Blimp1 – represor transkripce; Prmt5 - metyltransferáza [USEMAP] Embryonální zárodečné buňky – EGC (Embryonic germ cells) - EGC jsou odvozeny z primordiálních zárodečných buněk (PGC – primordial germ cell). -Podobně jako ES buňky je lze expandovat in vitro, a jsou pluripotentní, jak dokazuje jejich schopnost diferencovat do buněk všech tří zárodečných listů jak in vitro (EB), tak in vivo (chiméry a teratomy). - Z epigenetického pohledu (DNA metylace) jsou však více podobné PGC než ES buňkám - Rozdíly v metylaci DNA se týkají zejména imprintovaných genů v závislosti na pohlaví, u EGC izolovaných z pozdějších embryonálních stádií se tento rozdíl zmenšuje. Tyto „imprinting-free“ PGC, však již netvoří zdravé chimerické jedince. - U myší lze EGC izolovat z PGC mezi 8.5 – 12.5 dpc, později to již nelze - PGC a následně EGC lze izolovat in vitro z ES buněk (lidských i myších) -m/hEGC jsou závislé na LIF, během časné kultivace i na FGF2 a Stem cell faktoru (SCF; + feeder & FCS/SR). - Exprimují podobné markery jako ES buňky, lidské EGC jsou fenotypem více podobné mES než hES (morfologie + exprese SSEA-1!; u hES se SSEA-1 exprimuje až s jejich diferenciací) [USEMAP] Vznik EGC z PGC (Durcova-Hills 2008) [USEMAP] [USEMAP] Porovnání transktiptomů mES, mPGC a některých tkání R1, E14tg2a, TMA5 – linie mES buněk TMA55G (male), TMA58G (female) – EGC GS – germ stem cell (derived from spermatogonia) (Mise et al., 2008) [USEMAP] GTC_1211_f1 [USEMAP] GTC_1211_f2 blue – ES specifický patern red – PGC specifický patern purple - ES/PGC specifický patern green – nevýznamné pro specifikaci ES/PGC Analýza hlavních komponent expresních profilů [USEMAP] Donovan, 2003 Schema předpokládaného zapojení FGF, LIF a KL (c-Kit ligand = Steel factor (SF)/ stem cell factor (SCF) v regulaci sel-renewal EG buněk [USEMAP] Není původ ES buněk v PGC ??? Zwaka, 2005 [USEMAP] Není původ ES buněk v PGC ??? M- myš; H –člověk; N/D – netestováno; ES – embryonální kmenové buňky; EGC – časné primordiální zárodečné buňky (!); LGC – pozdní primordiální zárodečné buňky; ICM – vnitřní buněčná masa; PE – primitivní ectoderm/epiblast Zwaka, 2005 [USEMAP] Kmenové buňky teratomu / teratokarcinomu - ECC Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cells) - Izolované rozkultivováním a klonální selekcí buněk teratomu / teratokarcinomu - Lidské spontálně, myší indukované transplantací časných embryonálních buněk do dobře vyživované tkáně (varlata, ledviná kapsa, břišní dutina,…), musí být imunotolerance - Podobné vlastnosti jako ES buňky, ale méně závislé na specifických růstových faktorech (+) - Tvoří také chiméry, ale nedokonalé, většinou hynou v průběhu embryogeneze (-) - Většinou snížená schopnost pluripotence jak in vivo, tak in vitro (-) - Obecně nestabilní genotyp a časté aneuploidie (-) - - Modelové studie genetické nestability a diferenciace, vzniku teratomů - Levnější alternativa k ES buňkám, lepší stabilita v experimentálních systémech jak ES (+) [USEMAP] Donovan, 2003 Vztahy mezi pluripotentními buňkami a některé klíčové regulační komponenty těchto buněk Sl – Steel locus, Ter – Teratoma locus, pgct1 – primordial germ cell tumor susceptibility locus, PTEN – Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10, mTR (mTOR) - serine-threonine kinase mammalian target of rapamycin [USEMAP] Nature. 2013 Oct 30. doi: 10.1038/nature12745. [Epub ahead of print] Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Gafni O, Weinberger L, Mansour AA, Manor YS, Chomsky E, Ben-Yosef D, Kalma Y, Viukov S, Maza I, Zviran A, Rais Y, Shipony Z,Mukamel Z, Krupalnik V, Zerbib M, Geula S, Caspi I, Schneir D, Shwartz T, Gilad S, Amann-Zalcenstein D, Benjamin S, Amit I, Tanay A,Massarwa R, Novershtern N, Hanna JH. Source 1] The Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science, Rehovot 76100, Israel [2]. Abstract Mouse embryonic stem (ES) cells are isolated from the inner cell mass of blastocysts, and can be preserved in vitro in a naive inner-cell-mass-like configuration by providing exogenous stimulation with leukaemia inhibitory factor (LIF) and small molecule inhibition of ERK1/ERK2 and GSK3β signalling (termed 2i/LIF conditions). Hallmarks of naive pluripotency include driving Oct4(also known as Pou5f1) transcription by its distal enhancer, retaining a pre-inactivation X chromosome state, and global reduction in DNA methylation and in H3K27me3 repressive chromatin mark deposition on developmental regulatory gene promoters. Upon withdrawal of 2i/LIF, naive mouse ES cells can drift towards a primed pluripotent state resembling that of the post-implantation epiblast. Although human ES cells share several molecular features with naive mouse ES cells, they also share a variety of epigenetic properties with primed murine epiblast stem cells (EpiSCs). These include predominant use of the proximal enhancer element to maintain OCT4 expression, pronounced tendency for X chromosome inactivation in most female human ES cells, increase in DNA methylation and prominent deposition of H3K27me3 and bivalent domain acquisition on lineage regulatory genes. The feasibility of establishing human ground state naive pluripotency in vitro with equivalent molecular and functional features to those characterized in mouse ES cells remains to be defined. Here we establish defined conditions that facilitate the derivation of genetically unmodified human naive pluripotent stem cells from already established primed human ES cells, from somatic cells through induced pluripotent stem (iPS) cell reprogramming or directly from blastocysts. The novel naive pluripotent cells validated herein retain molecular characteristics and functional properties that are highly similar to mouse naive ES cells, and distinct from conventional primed human pluripotent cells. This includes competence in the generation of cross-species chimaeric mouse embryos that underwent organogenesis following microinjection of human naive iPS cells into mouse morulas. Collectively, our findings establish new avenues for regenerative medicine, patient-specific iPS cell disease modelling and the study of early human development in vitro and in vivo. [USEMAP] Capturing the ground state of human naive pluripotency. Lidské „naivní“ pluripotentní kmenové buňky (human naive hESC = ekvivalent mESC [USEMAP] Dospělé multipotentní zárodečné kmenové buňky (AMGDSC Adult multipotent germ-derived stem cell) - odvozeno ze spermatogonií - fenotyp velmi podobný ES buňkám - oproti ES buňkám snížená schopnost pluripotence – jen chiméry - pluripotence také in vitro [USEMAP] Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis. Guan K, Nayernia K, Maier LS, Wagner S, Dressel R, Lee JH, Nolte J, Wolf F, Li M, Engel W, Hasenfuss G. Nature. 2006 Apr 27;440(7088):1199-203. Condition II & IV + LIF [USEMAP] [USEMAP] [USEMAP] Concise review: challenging the pluripotency of human testis-derived ESC-like cells. Tapia N, Araúzo-Bravo MJ, Ko K, Schöler HR. Stem Cells. 2011 Aug;29(8):1165-9. V současnosti ale pochybnosti [USEMAP] Neurální lišta a kmenové buňky neurální lišty [USEMAP] 22 [USEMAP] gr1 Neural crest stem cell - NCSC Sebeobnova Růstové faktory - FGF2, Notch, Wnt Transkripční factory – Slug (Snai2), Sox10 Fenotyp - blízký NSC – exprese Nestinu (protein intermediálních filament) [USEMAP] Experiment potvrzujicí pluripotenci buněk neurální lišty [USEMAP] DBiologystr242 finito ESC iPSC ECC EGC maGSC ? EPLC epiSC Schopnost pluripotence – tvorba chimér a teratomů hESC hEGC(?) hiPSC(?) neural crest (? všechny) hECC [USEMAP] Kmenové buňky extraembryonálních tkání A)Kmenové buňky trofektodermu (trofoblastu) FGF-dependent (FGF4, FGFR2); Cdx2, Eomes, Errb B)Kmenové buňky primitivního entodermu (hypoblastu) XEN – buňky extraembryonálního entodermu blastomery ICM trofektoderm linie trofoblastu primitivní entoderm primitivní ektoderm zárodečný epiblast / embryoblast allantois amnion mezoderm žloutkového vaku viscerální entoderm parietální entoderm [USEMAP] Regulace kmenových buněk trofoblastu signály z epiblastu [USEMAP]