Tkáňové kultury E-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223 / 116 [USEMAP] Tkáňové kultury (= TK, Tissue culture - TC) – růst živočišných buněk a tkání in vitro 1885 – ROUX, kuřecí embryonální buňky v solném roztoku 1940 – EARLE, první kontinuálně kultivovaná linie, buňky myší pojivové ----------tkáně, jejím subklonem je dnešní linie L929 Provozování tkáňových kultur spočívá v zajištění optimálních podmínek pro růst a přežívání kultivovaných buněk / tkání! (Pro jednoduchost se dále budou uvažovat jen buňky, problematika tkání a orgánů bude stručně zmíněna na závěr.) [USEMAP] FYZIKÁLNÍ, CHEMICKÉ a BIOLOGICKÉ faktory, které je třeba regulovat za běžných laboratorních podmínek. TEPLOTA Buňky se kultivují při optimální teplotě pro organismus, z kterého byly izolovány. Pro buněčné linie odvozené od člověka a běžných laboratorních zvířat (myš, krysa, makak, pes,..) je to většinou 37oC. Pro buněčné linie odvozené od poikilotermních živočichů (ryby, hmyz, háďátko - Caenorhabditis) od 10 do 25oC. Různé druhy záření, tlak, různá pole, vibrace,… - dodržet podmínky na které jsou buňky zvyklé/přizpůsobené [USEMAP] Teplota modifikuje biochemické děje - s vyšší teplotou se urychlují chemické reakce - v závislosti na teplotě se mění i afinita substrátu k enzymům – Km (Michaelis-Menten koeficinet) Změna velikosti Km pro acetylcholin k acetylcholinesterázu (AChE) P – hlaváč, Rt – pstruh duhový, M – cípal, L -Elops Závislost Km na teplotě pro pyruvát a LDH u různých obratlovců Bt – tuňák obecný, R – králík, Ray – rejnok, M – hlaváč (Gobii) Pagothenia borchgrevink Elops Některé organismy mají tak více enzymových isoforem pro stejnou reakci pro snadnější regulaci homeostáze za různých teplot! [USEMAP] Na CHEMICKÉ faktory lze nahlížet jako na média (jejich komponenty) v kterých buňky rostou a plyny, které tato média obklopují případně jsou v nich rozpuštěny. Složení médií Veškeré komponenty použité pro přípravu médií musí být vysoké kvality, s minimem nežádoucích příměsí (minimální chemická čistota p.a. – pro analýzu) Základem je voda a v ní rozpuštěné anorganické soli. Soli jsou zdrojem nezbytných iontů, a hrají významnou úlohu v zajištění vhodného pH (optimium většinou 7.2-7.4) a osmotického tlaku / Osmomolarita (optimum většinou 280-320 mOsmol/L). Nejzákladnější ionty obsažené v médiích jsou: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO42-, PO43-, HCO3-. Osmotický tlak je roven koncentracím rozpuštěných iontů/molekul 1 M NaCl = 1 Osm/L Na+ + 1 Osm/L Cl- = 2 Osm/L 1 M CaCl2 = 1 Osm/L Ca2+ + 2 Osmol/L Cl- = 3 Osm/L 1 M glukósy = 1 Osm/L [USEMAP] Esenciální látky pro růst buněk Média musí také obsahovat sacharidy (většinou glukózu, jako zdroj energie), aminokyseliny (esenciální i neesenciální), vitaminy a stopové prvky. Většina zejména savčích buněk vyžaduje Insulin (příjem glukózy) Transferin (příjem železa) Selen (nezbytný pro funkci oxidačně-redukčních enzymů) – také tzv. minimální přídavek do médií Další doplňky Lipidy (mastné kyseliny), steroidní látky, hormony, cytokiny, peptidy, proteiny extracelulární matrix, proteiny séra, nukleosidy,… Mnohé z těchto látek jsou suplovány přídavkem séra (5 - 10 - 20%), v některých případech i jinými zdroji málo charakterizovaných směsí proteinů a dalších látek. Významnými doplňky jsou ochranné látky jako 2-b-merkaptoetanol (snižuje oxidativní stres a může sloužit i jako zdroj síry) a antibiotika (ochrana proti mikroorganismům případně selekční agens) [USEMAP] Základní média v tkáňových kulturách Základem jsou tzv. Earliho soli: chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, síran horečnatý, dihydrogenfosfát sodný BME with EBSS – základní (basal) médium s Earliho solemi Alfa MEM – alfa modifikované Eaglovo médium DMEM – Dulbekovo MEM, běžné pro adherentní buněčné linie RPMI 1640 – zejména buňky hematopoetického původu IMDM – Iscovovo modifikované Dulbeccovo médium, vhodné pro rychle rostoucí buňky (v základu neobsahuje Fe ionty) Hamovo F12 – médium bohaté živinami, často v kombinaci 1:1 s DMEM jako základ pro kultury bez séra [USEMAP] DMEM – high glucose [USEMAP] Sérum - nejčastěji bovinní fetální*, ale i jiné zdroje - lidské, koňské, kozí, myší,... - embryonálí (fetální), novorozenecká, dospělá *fetální => nízká hladina nízkoafinitních imunoglobulinů (protilátek) - různé stupně kvality - testy na přítomnost endotoxinů - testy na snášenlivost konkrétním typem buněk - testy na přítomnost virů - ..... - různé země původu (USA, Austrálie,...) - různé šarže (lot number) normální x inaktivní sérum - inaktivace séra = 30 (45) minut při 56 °C => inaktivace komplementu atd... [USEMAP] Při přípravě médií je pH nastaveno/doladěno HCl (1M) a NaOH (1M). pH v kultuře se mění v důsledku metabolismu buněk, zejména produkcí laktátu a CO2 V průběhu kultivace je udržováno: 1)Přítomnými ionty, zejména fosfátovými (z fosforečnanů) 2)Proteiny s pufračními schopnostmi 3)Systémem H2CO3 / CO2 4)Alternativně silně pufrujícími látkami jako je HEPES, BES, TES 5) K orientační detekci pH média v kultuře slouží fenolová červeň přidávaná do médií. pH < 6 7 < 8 pH [USEMAP] Wikipedia [USEMAP] Pufrační systém H2CO3 / CO2 (NaHCO3) CO2 + H2O = H2CO3 = H+ + HCO3- Kultivace : otevřená – s výměnou plynů (zejména přísun CO2 z vnějšku) uzavřená – bez výměny plynů (používá se ~ ½ množství NaHCO3) - Při otevřeném systému kultivace se nejčastěji udržuje atmosféra s navýšeným obsahem CO2, standardně 5% CO2 (regulovaný přísun ze zásobní bomby) a 95% vody (regulovaný přísun, nebo častěji spontánním odparem ze zásobníku. http://www2.biomed.cas.cz/d331/vade/ph.html [USEMAP] V některých speciálních případech je vhodné použít polotekutá až pevná média Takové médium se připraví přídavkem: - Agaru (je třeba dávat pozor na přehřátí složek média během přípravy, teplota by neměla být vyšší jak 40oC) - Metylcelulósy - - Kolagenu (transparentní, buňky lze barvit některými histologickými barvivy) - Fibrinogenu (po aktivaci -> fibrin / fibrinová síť) - - je možné použít i čistě syntetické polymery, např. metakryláty (hydrogely) [USEMAP] Trvanlivost a uchování médií a jejich doplňků !doporučení výrobce – dodavatele! •- Solné roztoky jsou stabilní i při R.T. (room temperature ~ 20oC) •- Většina složek média (aminokyseliny, vitaminy, sacharidy,..) je stabilní po dobu jednoho roku při 4oC a tmě •- Glutamin v roztoku se nejpozději po 3 měsících začne rozkládat = je třeba ho přidávat samostatně ze zamražéné zásoby. Jeden rok při 4oC se ale ješte považuje za akceptovatelný, možno nahradit médii s Glutamax a pod. •- Sérum při 4oC až 2 měsíce, při -20oC až 3 roky •- Obecně při teplotách pod -70oC je vše stabilní minimálně 1 rok •- Stabilita je závislá na tekutosti / zmrzlosti roztoku, což je ovlivněno složením a koncentrací rozpuštěných komponent. Např. soli a glycerol posouvá bod tuhnutí k nižším teplotám (při -20oC není 10% roztok glycerolu úplně zmrzlý) a DMSO k vyšším teplotám (tuhne už při ~ +6oC) [USEMAP] -Jiné buněčné linie (zkreslení výsledků buněčnou specializací, dominance invazní buněčné linie = zánik původní buněčné linie) - -Plísně, kvasinky, bakterie (toxiny, vyčerpání média = zkreslení výsledků, úhyn buněk, ohrožení experimentátora) • -Viry (zkreslení výsledků, úhyn buněk, ohrožení experimentátora) Biologické faktory – v kultuře roste ještě něco navíc než požadujeme = čistota kultury / sterilita 1.PREVENCE + MONITORING! 2. 2.LÉČENÍ [USEMAP] •PROVOZ • -Laboratoř TC (LTC) je pokud možno oddělená od ostatních prostor, nevětrá se přímo okny, ale pokud možno přes ventilační systém s filtrací -Pravidelně se provádí úklid a desinfekce povrchů (prostředky na bázi chloru – SAVO, Jodu – Ajatin, 70% EtOH nebo isopropylalkohol,….) -LTC je periodicky vysvěcována germicidní (širokospektré UV) lampou -Pracovníci LTC používají pracovní oblečení určené jen pro LTC a před vlastní prací si desinfikují ruce příslušnými prostředky (minimálně použití 70% EtOH) -S kulturami se pracuje pokud možnou pouze ve Flow-boxu • PREVENCE [USEMAP] MATERIÁL Čisté materiály se podle své odolnosti / vlastností sterilizují-desinfikují: (čistý z čistých surovin nebo po důkladném omytí speciálními detergenty) autoklávováním (120oC, 20-30 minut) – solné roztoky, některé pufry, agar, želatina/kolagen, některý plastik,.. suchým teplem (180oC, 3 až 4h) – sklo, vzácně některý plastik (do 120oC) zářením gama (vzácně i UV – jen povrchy) – plastik, sklo filtrováním - vzduch (HEPA filtry s póry 0,3 mm), roztoky hlavně média a séra běžně přes filtry s póry 0,2 mm) omytím (2-5% aldehydy, 70% EtOH, 2-5% fenol, 5-10% peroxid vodíku,….) – nástroje, pracovní plochy, některý plastik, sklo (celkově může být málo účinné a požkozující čištěný materiál) plamenem -kovy, sklo parami alkylačních činidel - někdy kombinace s autoklávováním (etylén oxid), speciální aplikace jako dekontaminace filtrů flow-boxů, dekontaminace místností (formaldehyd), vždy problém pro obsluhu! [USEMAP] Významným prevenčním agens v médiích jsou antibiotika. Kritéria pro antibiotika: - nesmí inhibovat růst a ani ovlivňovat metabolismus buněk - musí ochraňovat kulturu po celou dobu experimentu - netoxické a bezpečné pro uživatele - kompatibilní s ostatními složkami média - rozpustné v netoxických rozpouštědlech a) Ochranné proti mikroorganismům Nejčastěji preventivně Penicilin/Streptomycin nebo Gentamycin, léčení a speciální aplikace Tetracyklin , Sparfloxacin,… b) Selekční (viz. Příprava transgenních linií) Geneticin (G418), Hygromycin, Puromycin c) Speciální Mitomycin C (- blokue replikaci DNA, DNA crosslinker) [USEMAP] Bez názvu 1 kopie Přehled nejčastěji používaných antibiotik G+ ... grampozitivní bakterie G- ... gramnegativní bakterie IP ... inhibuje proteosyntézu ISBS ... inhibuje syntézu bakteriální stěny [USEMAP] MONITORING -V kultuře nebo v zásobních roztocích něco roste co tam nemá být • (plísně = chomáčky; kvasinky = pučící buňky, řetízky; bakterie = drobné útvary, kulovité až vláknité, někdy řetízky) -Dochází k rychlému vyčerpání média (rychle mění barvu z červené na žlutou = pokles pH) -Buňky špatně rostou, nemají správný tvar, adherentní se pouští podkladu -Mikroskopické barvení na celkovou DNA (zviditelnění mikroorganismů, zejména endoparaziti) -Stanovení specifických antigenů (Imunocytochemie, western blot) -Detekce specifických sekvencí pro jednotlivé organismy PCR metodou -Kontrolní kultivací médií samotných nebo po přídavku specifických substrátů -Výsledky experimentů nejsou reprodukovatelné / jsou chaotické -Buňky jsou citlivější ke stresu [USEMAP] LÉČENÍ - Likvidace zasažené kultury - Kombinací antibiotik - Kultivací buněk v kompatibilním organismu (např. v břišní dutině = ascites) ? [USEMAP] Chomáček plísně v kultuře 1 mm Kvasinky + Buňky (HL-60) 50 mm [USEMAP] - Běžným VIS mikroskopem prakticky nejsou vidět - Intracelulární bezestěné bakterie (trojvrstevná cytoplasmatická membrána) DETEKCE (je třeba kukltivovat bez antibiotik – možné přežívání na pozadí): - Vitální barvení na DNA (Hoechst) - Detekce specifických DNA sekvencí pomocí PCR - In situ hybridizace (RNA , DNA) - Měření enzymatické aktivity, systémy s transgenními buňkami (fy. Invivogene,…) - (Inkorporace uracilu (mycoplasmata) X uridinu (eukaryontní buňky)) - ZDROJE: - infikované buňky v TC! - práce se zvířaty v laboratoři TC - pracovníci laboratoře TC LÉČENÍ: - Kombinací antibiotik - Pasážováním buněk v kompatibilním organismu (ascites – volně v břišní dutině) Mycoplasmata [USEMAP] mycop Viabilita některých druhů mycoplasmat za různých podmínek [USEMAP] Obecné schéma léčení buněčných linií v LTK na mycoplasmata [USEMAP] Příklad postupu léčení buněčné kultury na mycoplasmata přípravkem BM-cyclin fy Roche [USEMAP] Mycoplasma erradication1_Page_2_Image_0001 Účinnost komerčně dostupných antibiotik v léčení kultur napadených mycolpasmaty Uphoff & Drexler 2001 n – počet testovaných buněčných linií [USEMAP] MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit MycoZap™ Mycoplasma Elimination Reagent Zdravá buněčná kultura Buněčná kultura infikovaná mycoplasmaty (vitální barvení pomocí Hoechst 33258) [USEMAP] Základní vybavení laboratoře tkáňových kultur Inverzní mikroskop CO2 inkubátor [USEMAP] Flow-box / laminární box - základní [USEMAP] Flow-box / laminární box – biohazard, [USEMAP] Počítač částic Průtokový cytometr / Flow-cytometer (FACS) [USEMAP] [USEMAP] [USEMAP] •- Inkubátor / termostat s regulací teploty a složení atmosféry •- Flow-box = laminární box •- Inverzní mikroskop, nejlépe s fázovým kontrastem (Nomarského – vnitřní struktura buněk; Hoffmanův (reliéfní) – plastické znázornění povrchů) •- Počítač částic (hemocytometr, Bürkrova komůrka, Coulter Counter, FACS,..) •- Lednice a mrazáky •- Kontejner s tekutým N2 (-196oC), nebo extrémně hluboko-mrazící box (-150oC a méně) •- Autokláv (parní sterilizátor), horkovzdušný sterilizátor •- Centrifuga •- Pipetor / Pipetus (manuální nebo elektronický) •- Automatické pipety •- Technické zázemí – umývárna, sklad, šatna,… • [USEMAP]