Podle způsobu kultivace - Adherentní (většina, rostou přichyceny k podkladu) - Suspenzní (zejména buňky krve a jejich deriváty, volně se vznášejí v médiu) BUŇKY V TC Adherentní – (linie HaCaT) Suspenzní – (linie HL60) 100 mm [USEMAP] PROLIFERACE x DIFERENCIACE x APOPTÓZA Buňky a jejich vlastnosti (v TC). [USEMAP] PROLIFERACE = dělení buněk [USEMAP] DIFERENCIACE = rozrůzňování buněk 75% 25% Velká mřížka oplozené vajíčko [USEMAP] [USEMAP] apoptoza-necroza Apoptósa (+ nekrósa) – smrt buňky x viabilita buněk [USEMAP] Podle původu a vlastností - Primokultury Buňky izolované většinou ze zdravé tkáně (obecně zdravý genom, ale většinou omezené možnosti kultivace/dělení buněk) - Permanentní linie Nejčastěji buňky izolované z nádorů, ale mohu být i ze zdravé tkáně, případně ze zdravé tkáně a imortalizované (většina chyby v genomu -> nestabilita, jsou ale nesmrtelné), adaptace na podmínky in vitro!!! [USEMAP] PRIMOKULTURY PERMANENTNÍ LINIE heterogení klon omezená životnost (H.l.) nesmrtelné Většinou náročnější na kultivaci Obecně snadno kultivovatelné variabilita izolací genetická nestabilita BUŇKY NORMÁLNÍ IMORTALIZOVANÉ NÁDOROVÉ diploidní diploidní / aneuploidní diploidní / aneuploidní /polyploidní senescence / Hayflick limit nesmrtelnost nesmrtelnost Růst závislý na kontaktu s podložkou (anchorage-dependent) Růst závislý na kontaktu s podložkou (anchorage-dependent) Růst je nezávislý na kontaktu s posdložkou (anchorage-independent) +++/- specifické růstové faktory +/- specifické růstové faktory +/--- specifické růstové faktory netvoří nádory netvoří nádory tvoří nádory [USEMAP] A)Buňky se v kultuře nedělí – je třeba periodicky měnit kultivační médium (terminálně diferencované, postmitotické buňky, často u primokultur) B)Buňky se v kultuře dělí = proliferují – je třeba je pasážovat (ředit a měnit médium, většina buněk primokultur a permanentních linií) Pasážování – periodické „ředění buněk“, obecně spojené i s výměnou média RŮST BUNĚK V TC Adherentní linie* – mechanicky nebo enzymatickým štěpením vazeb buňky / substrát; buňka / buňka Enzymy - trypsin, colagenáza,..; inaktivace spec. inhibitory, vyředěním, nadbytkem proteinů (např. sérem) Pomocné látky – EDTA (zejména vychytávání Ca2+) Suspenzní linie – prostým ředěním * Ve většině případů je u adherentních linií nutno počítat s jejich zvýšenými nároky na kvalitu podkladu, na kterém rostou. Běžně se používá ošetření 0.01 – 0.1 % roztokem želatiny (prasečí, hovězí) v dH2O. Podle potřeby a typu buněk se používají ale i ostatní proteiny ECM. [USEMAP] Pasážování buněk pomocí tzv. trypsinizace (enzymatické rozvolnění) konfluentní buňky (100%) rozvolněné konfluentní buňky nová pasáž (konfluence ~20%) enzymaticky rozvolněné buňky (suspenze) část buněk na novou misku, do nového média rozvolnění buněk deplecí Ca2+ iontů (chelatony např. EDTA) enzymaticke štepení např. trypsinem růst kultury [USEMAP] Dále je buněčná proliferace charakterizována: Buněčná - denzita – počet buněk na ml nebo cm2 - konfluence – počet buněk na plochu u adherentních linií (b. / cm2, častěji „%“ plochy) Generační dobou - doba mezi dvěma mitózami / rozděleními buňky = délka buněčného cyklu Doubling time – čas potřebný ke zdvojnásobení buněk v populaci Hayflickův limit – v případě většiny primokultur počet možných dělení, buněčně specifické (senescence – stárnutí buněk, „quiescence – klid/spánek buněk“) Proliferaci buněk v kultuře charakterizuje růstová křivka s 3 fázemi Čas Lag fáze Logaritmická (růstová) fáze Stacionární fáze [USEMAP] Analýza buněčné proliferace Počítáním buněk - v mikroskopu (Bürkrova komůrka / hemocytometr) - přístroji (Coulter counter – počítač částic, FACS – , průtokový cytometr, u většiny přístrojů potřeba vnitřního standardu) Přírůstek v množství DNA (lze použít i pro jednotlivou buňku) - Inkorporace 3H thymidinu (měří se přírůstek radioaktivity, celkový, nebo u jednotlivé buňky) - Inkorporace BrdU (bromdeoxyuridinu, analog thymidinu), množství BrdU se stanoví pomocí protilátky (lze na populaci i jednotlivé buňce), nověji EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) - Celkové množství DNA v buňce -> stanovení fáze buněčného cyklu [USEMAP] Image1 sada1-komplet_0001 [USEMAP] Průtokový cytometr (Flow-cytometr / FACS) [USEMAP] Přírůstek celkových proteinů - nepoužitelné u buněk produkujících velké množství extracelulární matrix (ECM) Stanovení enzymatické aktivity (enzymy permanentních metabolických drah) - testy využívající tetrazoliové soli (např. MTT, WST-1), které jsou redukovány na barevné formazany, které se dají stanovit spektrofotometricky (různé tetrazoliové soli jsou různě citlivé pro jednotlivé enzymatické (oxidačně redukční, NADP) systémy a i vhodné pro různé typy buněk) - Stanovení celkového množství ATP Stanovení exprese specifických proteinů spřažených s proliferací - imunohistochemicky (jednotlivé buňky) - western blotem (celkově v populaci) (PCNA, Ki-67, cykliny, inhibitory na cyklinech závislých kináz (cyklin-dependentní kinázy),.. Nedílnou součástí sledování proliferační aktivity buněk je i detekce jejich životaschopnosti = viability, která je spojená s buněčnou smrtí = apoptózou, případně s nekrózou [USEMAP] Analýza viability a apoptózy [USEMAP] A) Testy založeny na kompaktnosti zdravé buňky a jejím „správném“ chování / funkci - Morfologické změny (apoptická tělíska, výběžky, …) - Schopnost vylučovat barviva živými buňkami (eosin, bromfenolovou modř pro detekci ve VIS, propidium iodid pro fluorescenci: mikroskopicky, FACS) - Enzymatická aktivita, nejčasteji esterázy (fluorescein diacetát pro fluorescenci: mikroskopicky, FACS, možno kombinovat s propidium iodidem) - U adherentních buněk lze hodnotit počet adherovaných a plovoucích (mrtvých / apoptických buněk - Změny ve struktuře cytoplasmatické membrány -> anexin / fosfatidylseriny [USEMAP] annexin PSAnnexin annexin-v-kit-antibody-kit-19cc-image1 F2 Annexin assay [USEMAP] B) Testy založeny na stanovení biochemických a molekulárně biologických parametrů - Fragmentace DNA (elektroforeticky = tzv. apop. žebříček DNA, in situ = TUNEL assay, Comet assay) - Aktivita specifických proteáz = kaspásy, detekce fragmentace substrátů kaspás - - Hladiny pro- a anti-apoptických proteinů rodiny Bcl-2 - - Kompaktnost mitochondrií (změny v polarizaci m. membrány, vylití cytochromu c) Abrdu TUNEL assay, red – nuclei, green apoptosis TUNEL – Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling [USEMAP] 09-03SwineConf7 2339f1 Comet assay Eosin (Trypan blue) stain of viability [USEMAP] F1 [USEMAP] Diferenciace buněk V průběhu kultivace (pasážování) buněk se volbou vhodných podmínek snažíme, aby si buňky dlouhodobě zachovali stabilní genotyp i fenotym. Přitom u nádorových línií je udržení stabilního genotypu už z principu problematické. Změny kultivačních podmínek mohou vést k nestabilitě již tak obecně nestabilního geneotypu u nádorových linií, ale vedou zejména ke změně fenotypu => diferenciaci, a to jak cílené tak náhodné. DIFERENCIACE JE PRAKTICKY VŽDY SPOJENA I SE ZMĚNOU PROLIFERAČNÍCH PARAMETRŮ, PŘÍPADNĚ I S APOPTÓZOU. Parametry analýzy diferenciace: - změny v morfologii buněk - změny v expresi genů: detekce specifických mRNA a specifických proteinů (v časných stádiích zejména transkripční faktory, později zejména strukturní proteiny a enzymy) - funkční testy (fagocyty – fagocytóza; nervy – přenos signálu, depolarizace membrány, produkce mediátorů; svaly – odpověď na stimulus, kontrakce; epitely - produkce mucinů;…..; transplantace a sledování jak se transplantované buňky zapojí do funkce dané tkáně) [USEMAP] Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci EC buněk 6 days RT-PCR analýza exprese liniově specifických genů l neuroektoderm l entoderm [USEMAP] III b-tubulin Nediferencované buňky EC Diferencované buňky EC monovrstva + RA - sérum Diferencovane buňky EC monovrstva + RA + sérum u buněčná jádra u cytokeratin EndoA pozitivní buňky – entoderm u N-CAM pozitivní buňky - neurony Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci EC buněk [USEMAP] ES D3 [USEMAP] Elektrofyziologické parametry kardiomyocytů jako součást identifikace jejich fenotypu Akční potenciál atriálního kardiomyocytu Akční potenciál ventrikulárního kardiomyocytu [USEMAP] Zdroje buněk v TC C) Příprava primokultur z živočišných tkání B) Příprava kmenů (populace) nebo klonů (z jednotlivé buňky) z nádorů Izolace nádoru, jeho enzymatická disociace na buněčnou suspenzi, kultivace buněk ve vhodných podmínkách, selekce zajímavých kmenů, klonů a jejich charakterizace v průběhu kultivace -> linie musí vykazovat dostatečnou stabilitu v průběhu kultivace, aby byla zachována reprodukovatelnost výsledků. Popis nově získané linie by měl obsahovat co nejvíce její chrakteristik. Původ (typ nádoru, věk a pohlaví dárce, způsob získání, počet pasáží od jejího ustanovení, charakterizace fenotypu i genotypu,..) A) Tkáňová banka nebo darem např. American Tissue Culture Colection (www.atcc.com) [USEMAP] Příprava myších embryonálních fibroblastů MEF – mouse embryonic fibroblast PEF – primordial embryonic fibroblast - Připravují se nejčastěji z 13.5 denních embryí (11-13.5 dpc.) - Gravidní samice se usmrtí a vypreparuje se děloha s embryi - Z embryí se odstraní hlava a vnitřní orgány - Zbytek embrya se enzymaticky a mechanicky rozruší a po odstranění kompaktních zbytků, se suspenze vyseje na kultivační misku - Rozrostlé buňky se zamrazí (pasáž 0) a nebo se dále kultivují (~6-15 pasáží ~ 24-60 dnů, Hayflick limit) [USEMAP] Příprava stromálních buněk kostní dřeně BMSC – bone marow stromal cells - Vypreparujeme stehenní kost, odstřihneme hlavice a propláchneme (např. injekční stříkačkou) vhodným kultivačním médiem do kutivační misky (lze i kost navrtat a odsát (např. injekční stříkačkou) = možné autotransplantace). - Po 24 hodinách kultivace odstraníme médium se zbylými krevními elementy opláchneme a přidáme nové médium. - Stromální buňky postupně vytváří nepravidelné kolonie fibroblastům podobných buněk - Standardně je lze kultivovat minimálně 2-3 týdny - Pozn. potkaní a lidské rostou lépe jak myší [USEMAP] mouseBl-1 ICM Linie ES buněk na feederu MEF 4-5 dní Fibroblastová výživná vrstva „feeder“- tvořená MEF TE Odstranění PEF Homogenní populace ES buněk Esd3_nguprav ES-D3-1uprav Vyseknutí a disociace ICM Příprava myších ES buněk ES – embryonic stem, embryonální kmenové Upraveno podle Kroupová 2004 [USEMAP] Dlouhodobé uchování buněčných linií v TC Permanentní kultivace - selekce buněk s odlišnými vlastnostmi než měly ty původní - - časově a finančně náročné • Empiricky je za stabilní považováno 10 – 30 pasáží v závislosti na buněčné linii a i na kultivačních podmínkách. • • Nádorové linie jsou obecně méně stabilní (poškozený genotyp) než primokultury (zde ale nevýhoda Hayflickova limitu). • Výjimkou se v současné době zdají být myší ES buňky, u kterých jsou známy kultivační podmínky, kdy dlouhodobě (> 100 pasáží) v zásadě nemění své vlastnosti. [USEMAP] Zamražování buněk Obecně v kultivačním médiu a)se zvýšeným obsahem séra (20-100%) b)se sérem (10-20-50%) s přídavkem DMSO (5-10%) c)vzácně se sérem (10-20-50%) a přídavkem glycerolu (10%) Buňky je třeba zchlazovat postupně na ~ -80oC, poté se přenesou do ultra-hlubokomrazícího boxu (~ -185oC) nebo do tekutého N2 (-196oC) k trvalému uchování. Je vhodné pro zamražení používat vysoké koncentrace buněk ~ >107 buněk na ml média. [USEMAP] Postupné zchlazování - V lázni s isopropylalkoholem (R.T.), přenos přímo do hlubokomrazícího boxu (~ -80oC), teplota klesá rychlostí ~ 1oC za 1 minutu - Zanořováním do par N2 - V termoisolačním materiálu (např. pěnový polystyren) přímo do hlubokomrazícího boxu, po 3 hodinách k trvalému uchování - V termoisolačním materiálu na ~ 2-4h do mrazícího boxu (-20oC), pak na 3 hodiny do hlubokomrazícího boxu, následně k trvalému uchování - Teplota nesmí kolísat, zejména k vyším teplotám [USEMAP] Rozmražování buněk Buňky je třeba rychle převést z hlubokého zamražení (~ 190oC) na kultivační teplotu, opláchnout zamražovací médium (centrifugací) a vyset k další kultivaci. Druhý den po vysetí je vhodné vyměnit kultivační médium za nové a odstranit tak zbytky buněk, které zamražení/rozmražení nepřežily. Dewarovy nádoby Kryo-zkumavky [USEMAP] Přeprava buněk - V zamraženém stavu v tekutém N2 (v termosce, dálková, lokální přeprava) - V zamraženém stavu v isolačním boxu se suchým ledem (CO2) (na krátké i velké vzdálenosti, zásilkové společnosti mívají i službu s doplňováním suchého ledu) - Živé v kultuře, v kultivační nádobce s nadbytkem média (v závislosti na buněčném typu 1 – 3 dny), každopádně i zde je se třeba vyhnout teplotním výkyvům buňky nesmí zmrznou ani se přehřát => 0-40°C - Tkáně (s výjimkou krve) se přepravují podchlazené (ne zmrzlé) ve výživných médiích, často s kryo-protektivy [USEMAP] Synchronizace buněk v buněčném cyklu Fyzikální metody - Setřásání mitotických buněk u adherentních kultur - Centrifugace (G0/G1 buňky jsou nejlehčí) a) v gradientu b) elutrace (centrifugace s protiproudem média) - FACS, sortrování pomocí flow-cytometru - Membránové vymývání (zdokonalená metoda setřásání) - Kontaktní inhibice Chemické metody - Deprivace odstraněním růstových faktorů (sérem) - Deprivace odstraněním iso-leucinu z média - Deprivace odstraněním Ca2+ - Přídavek hydroxyurei, inhibice RNA syntésy -> blok DNA syntézy - Dvojitý thymidinový blok - Mitotické jedy, inhibují reorganizaci mikrotubulů / dělícího vřeténka (kolchicin, kolcemid, nocodazol, …) – zejména zviditelnění chromozomů, karyotipyzace [USEMAP] Fucci system (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator; Sakue-Sawano et al., 2008) Výsledek obrázku pro fucci system http://www.amalgaam.co.jp/products/advanced/img/fucci/fucci.jpg http://www.olympusamerica.com/seg_section/fv10i/images/P4_1_H1.png https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQOjmRzpssRIzrVI6oXOp64_wKxgqkfL-nIoUE5ToyRypJ g84w9 [USEMAP] Srovnání synchronizace v buněčném cyklu deprivací sérem (A) a kontaktní inhibicí (B) Příklad rozjezdu buněk synchronizovaných deprivací sérem myší fibroblasty linie NIH/3T3 [USEMAP] doublThyBlock Princip dvojitého bloku přídavkem nadbytku thymidinu - nadbytek thymidinu blokuje průchod S-fází buněčného cyklu, blokuje DNA syntézu elutracniKyveta Elutrační kyveta / hylzna - separace buněk pomocí protiproudého gradientu na speciální centrifuze - elutrátoru [USEMAP] Současná kultivace více buněčných typů - Produkce růstových faktorů s parakrinním účinkem - Vhodné mechanické vlastnosti podkladu atd. V případě přímého kontaktu odlišení buněk na základě jejich vlastností - Exprese specifických proteinových markerů na povrchu buněk - - Selekce díky expresi nějakého proteinu (enzymu, fluoreskujících proteinů,.. - - Inhibice mitotické aktivity jednoho typu buněk (gama zářením, Mytomycinem C,..) Pokud je třeba maximálně minimalizovat riziko vzájemné kontaminace - Buňky v kultuře jsou odděleny polopropustnými membránami [USEMAP] 3-D kultivace Dostupnost živin a odstraňování zplodin metabolismu je limitující, většina buněk v TK je předurčena určitému fenotypu ~ netvoří cévy Difúzní koeficienty (cm2 / s) pro O2 a CO2 pro různé biologické materiály O2 CO2 vzduch (0°C) 0,178 0,139 (20°C) 0,20 voda (20°C) 20x10-6 18x10-6 (37°C) 33x10-6 lidské plíce (37°C) 23x10-6 svaly (20°C) 14x10-6 kůže mloka (25°C) 14x10-6 pojivová tkáň (20°C) 12x10-6 rosol žabího vajíčka (20°C) 10,2x10-6 obal žraločího vajíčka (15°C) 3,0x10-6 kůže úhoře (14°C) 2,4x10-6 obal lososí jikry (5-15°C) 1,8x10-6 Chitin (20°C) 0,7x10-6 http://d1dvw62tmnyoft.cloudfront.net/content/joces/125/13/3015/F2.large.jpg?width=800&height=600&ca rousel=1 [USEMAP] http://www.nature.com/nrm/journal/v15/n10/images/nrm3873-f2.jpg [USEMAP] http://www.pnas.org/content/106/44/18457/F3.large.jpg Kultivace na propustných a porézních materiálech [USEMAP] [USEMAP] EBkapky2 embryoidní tělíska Sféroidy & Organoidy http://www.sciencephoto.com/image/684614/large/C0264145-Neurosphere,_SEM-SPL.jpg http://www.omicsonline.org/JADPimages/2161-0460-S10-001-g001.gif neurosféry mamosféry embryoidní tělíska [USEMAP] [USEMAP] Tkáňové řezy - na pomezí kultivace buněk a tkání/orgánů Vlastnosti (výhody x nevýhody) -Dospělé, zdravé buňky, podobné buněčným primokulturám -Žádné nebo omezené schopnosti expanze -Zachování kontaktů mezi buňkami jako v tkáni -Morfologie buněk jako v tkáni -Částečné zachování 3D struktury tkáně (limit pro difúzi O2, tlouštka řezu – max 300mm) -Studie více odpovídají studiím na tkáních než jak je tomu u buněčných líniích -Velmi omezená dostupnost lidských vzorků, ale lepší jak pro tkáně/orgány -Výrazně jednoduší kultivace než tkání/orgánů -….atd. [USEMAP] -Kultivace na mřížce = přísun média/živin z obou stran řezu -Nízký sloupec media nad vzorkem = dostečný přísun O2 -Vysoký sloupec média pod vzorkem (mřížkou) = dostatečná pufrační kapacita pro pH a zplodiny metabolismu + dostatek substrátů pro metabolismus 2 cm [USEMAP] Vesci, et al., 2015 [USEMAP] Maund et al., 201 [USEMAP] Krumdieck tissue slicer Vibratome Přístroje pro tkáňové řezy [USEMAP]