Aglutinační metody •Ag + Ab ® Ag-Ab •aglutinogen aglutinin aglutinát - -princip : KORPUSKULÁRNÍ / částicový / Ag, -solubilní je vázán na částice •při reakci dochází ke shlukování Ag a Ab na základě vytváření můstků - Ab mezi buňkami za vzniku shluků •přímá – použití bakterií, buněk •nepřímá, pasivní – na jejich povrch je Ag uměle navázán, př.latex-fixační test, HIT •Předpoklady ke vzniku vazeb: 1.dostatek Ab 2.přítomnost Ab proti různým epitopům 3.vzdálenost mezi částicemi co největší 4. Ab funkčně jednovazebné nevytváří aglutinaci (IgA mono, IgE, IgG) – inkompletní Ab viz hemaglutinace • Aglutinace •využití : ke stanovení Ag, Ab, H (viz precipitační metody) 1.K určování izolovaných bakteriálních kmenů 2.K průkazu Ab proti patogenům –Widalova reakce – průkaz tyfu (Salmonella typhi), paratyfu (Salmonella paratyphi) A,B,C, Weil-Felixova – skvrnitého tyfu (Rickettsia prowazekii) Proteus vulgaris, Ab proti Francisella tularensis, •3. K průkazu Treponema p., EBV – mononukleóza, brucelózy, listeriózy •4. Nepřímá - Ab proti autoAg, př. k průkazu auto Ab proti štítné žláze • • • • • Hodnocení aglutinace: kvalitativně - odečtení okem kvantitativně : a) zjištěním množství aglutinátu b) zjištěním množství Ag v aglutinátu či supernatantu Rozdíl mezi aglutinací a precipitací •Latexová aglutinace, latex-fixační test •rychlé kvalitativní stanovení •Ag nebo Ab imobilizován na latexových kuličkách •Stanovení Ab proti IgG – revmatoidní faktor •Průkaz patogenních Antigenů (Helicobacter pylori, Adeno- a Rotavirus atd) • Latexová aglutinace, latex-fixační test Hemaglutinační •Ag + Ab ® Ag-Ab •hemaglutinogen hemaglutin hemaglutinát •- savčí krvinky (i části) •- dochází ke shlukování krvinek, vlivem komplementu či virové částice pak dochází k LYZI. • •Ke zviditelnění aglutinačních reakcí při použití •inkompletních Ab je možno použít • a) aglutinaci v bílkovinném prostředí b) v prostředí s proteolytickými enzymy c) použitím antiglobulinového Coombsova séra - králičí ab proti lidským Ig Hemaglutinace -využití: K zjišťování krevních skupin a průkaz Ab proti krevním elementům. Přímý Coombsův test – k průkazu navázaných antierytrocytárních Ab, reakce pacientových ery s Coombsovým antisérem, přítomnost navázaných Ab se projeví hemaglutinátem -Nepřímý Coombsův test – k průkazu cirkulujících antierytrocytárních Ab -1. fáze, pacinetovo sérum s ery od dárce, navázání Ab pokud jsou přítomny, vymytí, přidání Coomsova séra, které způsobí aglutinaci •Využití při 2 reakcích: •* KFR – komlement fixační reakce •* HIT – hemaglutinačně inhibiční test : • • HIT • •Patří také mezi metody serologické, založené na inhibici biologických účinků antigenů • •HIT – pasivní hemaglutinace •Vycházíme ze skutečnosti, že viry (některé bakterie atd) mají schopnost se spontánně absorbovat na červené krvinky (rozpustný Ag). •Ery pak aglutinují – shlukují se jen v přítomnosti specifické Ab •· odpovídá-li protilátka Ag, po přidání obalených ERY Antigenem se na Ag naváže a vznikne HEMAGLUTINÁT •Ab + Ag - Ery ® hemaglutinát, proběhne hemaglutinace • •· • HIT •neodpovídá-li protilátka virovému (bakteriálnímu) Ag, nedojde k hemaglutinaci •situace, kdy přidáme stejný Ag do reakce • Ab + Ag - Ery ® hemaglutinát + stejný Ag ® Ag -Ab + Ag - Ery ® inhibice hemaglutinace • •Metodou inhibice pasivní hemaglutinace lze dokázat velmi malé mn. rozpustného Ag nebo H (metoda je velmi citlivá) •pro vyhodnocení můžeme použít i optické metody •Využití: Průkaz Ab proti patogenní Ag jako Candida Albicans, Aspergillus fumigatus, Treponema pallidum •