Koncepce předmětu spec. imunolog. metody Bi 9250C, zimní semestr 2018 Časový rozpis blokového cvičení z předmětu Speciální cvičení z imunologie 14 studentů, 2h/2kredity Pomůcky s sebou: přezůvky a plášť, protokoly, mobil na focení, flešku, svačinu V praktickém cvičení se budeme zabývat testy následujícími metodami aktivity IS a) bezobratlých b) obratlovců Metody: odběr a zpracování krve (krevní diferenciál), odběr hemolymfy; ELISA – 1. stanovení přítomnosti protilátek proti B.b.s.l. (Borrelia afzelii, garinii, sensu stricto), stanovení přítomnosti protilátek proti COVID-19; Test aktivity a cytotoxicity lymfocytů; rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti Ag nebo Ab; test (stanovení aktivity jaterního enzymu); pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu); test aktivity fagocytózy pomocí fagocytovaných částic u hemocytů hmyzu; izolace slinných žlaz z klíštěte, příprava preparátu roztěrem střev klíšťete; průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka – nepřímá hemaglutinace (metoda HIT). Termín: út.-pá. 11. – 14.5. od 8.30hod do cca 15-16hod út 8:30 Instruktáž: ke cvičení toho dne 1. krevní roztěr, barvení a příprava séra 2. příprava destiček na ELISA, chystání antigenu na destičky 3. stanovení ALT 4. imunochromatograf . test HIV, losování na další testy. postupný odběr krve z prstu, ELISA - Et OH, promývání destiček, zjišťování konc. antigenu, ředění Ag, kalibrační křivka a napipetování na destičku; v mezičase barvení roztěrů a krevní diferenciál; stanovení ALT, losování na imunochromatický test, zpracování krve na sérum Pomůcky: ELISA: připravené A volné destičky, Ag už sonifikovaný, albumin, činidla na kalibraci, vazebný rozt ok, lednička, et-OH Předání pokynů a protokolů na imunochromatografický test- ruleta ALT: sérum, ELISA reader s filtrem 340 nm, epiny, destičku Odběr krve: rukavice, stojánek, skla na roztěr, desinfekce, jehly, souprava na barvení-Leukodif, pi pety, špičky, odpadní nádoba, stojánky, ependorfky, papírky na losování st 8:30 Instruktáž: 1. imunochromatografické testy 2. Test aktivity lymfocytů 3. odběr hemolymfy z larev Za víječe voskového, kultivace se škrobovými částicemi a sledování fagocytárních schopností hemolymfy, barvení skel a prohlížení hemocytů pod mikrokopem, počítání FI a % F, krevní diferenciál; 4. Izola ce slinných žlaz z klíštěte, příprava preparátu ze střev klíštěte 5. úprava destiček na ELISA -pokr ačování: odstranění Ag a promytí, napipetování vazebného roztoku s kaseinem, inkubace s kaseinem, p romytí destiček; Pomůcky: Fagocytóza: Leukodif, roztok škrobových zrn, larvy, sklíčka na roztěry, termostat, malé epiny, pinzety, nůžky, stříkačky a jehly Pipety, špičky, odpadní nádoba, stojánky, ependorfky, teplotní lázeň, malý termostat. ELISA: blokovací-vazebný roztok s kaseinem, promývací roztok, promývačka čt 8:30 Instruktáž: 1. samotná ELISA ředění sér, rozložení vzorků na destičku, příprava zředěných sér: inkubace destičky se séry (naředit konjugát), promytí destičky, nanesení konjugátu, inkubace s konjugátem (nachystat substrátový roztok s OPD), promytí a nanesení substr. roztoku, inkubace se substrátem, zastavení reakce pomocí H[2]SO4, měření na ELISA-readeru, v mezičase: krevní diferenciál, FI, % fagocytózy. Pomůcky: ELISA: blokovací roztok, promývací roztok, promývačka, konjugát, substrátový roztok, substrát, H[2]SO4, ELISA-reader na 492 nm Pipety, špičky, stojánky, ependorfky Pomůcky: Komerční diagnostika (EXBIO Olomouc) anti-A (IgM) monoklonální, anti-B (IgM) monoklonální, anti-H monoklonální; náplav diagnostických erytrocytů A, B, 0; bromelin, pufrovaný fyziologický roztok 0,85% (0,15 mmol/l) NaCl, destičky na odečítání výsledků, vodní lázeň na 100 C°, centrifuga, zkumavky, stojánky na zkumavky, pipety, špičky, rukavice, roztok ajatinu, nádobky na odpad, fixy. pá 8:30 Instruktáž – metoda HIT 1. metoda HIT - průkaz přítomnosti antigenů krevního systému AB0 ve slinách člověka, 2. dokončení všech metod, kontrola protokolů Přehled metodik: Odběr a zpracování krve, příprava séra, stanovení krevního diferenciálu ELISA - stanovení přítomnosti protilátek proti B.b.s.l. ELISA - stanovení přítomnosti protilátek proti COVID-19 Tudbidimetrické stanovení přítomnosti enzymu ALT Test aktivity a cytotoxicity lymfocytů, ATP test Test aktivity jaterních buněk, ALT test Pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu), barvení buněk Test aktivity fagocytózy pomocí škrobových zrn u fagocytů hmyzu, barvení buněk Izolace slinných žlaz z klíštěte, příprava preparátu ze střev klíštěte Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka (HIT) Rychlý kvalitativní test pro stanovení přítomnosti HIV viru Dále výběr z dalších testů Rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti hemoglobinu ve stolici - individuální stanovení Rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti Helicobacter pylori ve stolici Rychlý test pro stanovení Streptococcus A (pyogenes) ve stěru hrdla Rychlý test pro stanovení Streptococcus pneumoniae v moči